b******n
发帖数: 4225 | 1 可能咱们追求的目标不太相同
我想如果是那个shuttle vector能正常work的话（也就是两个细菌都能正常复制）
说明上面两个origin都能work的话
那么你弄清楚这个细菌x来源的origin是什么你才知道你设计的引物是不是对的
我知道你是根据文献报道设计的
现在是你的PCR不能扩增出来那么很可能是引物和模板不配对
引物你确定没问题，那么可能是模板出了问题
所以我让你去测序那个origin啊
加样孔不干净你把模板DNA酚氯仿抽提酒精沉淀一下可以了
不是大问题
我不认为PCR没结果不是因为PCR本身，
因为 1) PCR太常规了，出错机会很小，而且容易设立对照排除
2) 你设计的引物直接测序测不出，无论是E.coli来源的质粒还是细菌x来源的质粒
我个人觉得现在问题指向的是模板 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 谢谢这么详尽的trouble shooting
1. 限制性内切酶切E.coli plasmid显示，根据我们手上有的序列信息，如果只切E.
coli源的那
一半，酶切图谱就是正确的；如果在细菌X的origin那一段序列也切，酶切图谱就不能
完全吻合。所
以现在已经放弃用那个E.coli plasmid。
2.这个E.coli plasmid，同一管样品，别的人做PCR，还有ligation，酶切等等（都在E
.coli
源的那一半）是完全没有问题的，所以排除E.coli plasmid不够纯的问题。
3.同样的PCR master mix，用不同模板、引物，是可以PCR没有问题的，所以和试剂没
有关系。
4.引物序列等等已经确认过很多次；不过我没有确认到底有多少DNA在里面，谢谢提醒
，回头会查查
看。
5.要扩增的序列GC%是60%，不算特别高。PCR enhancer等等也试过，没有帮助。
6.我还提到如果不加DNA聚合酶的话加样孔里就没有东西；后来试过酚氯仿提取、乙醇
沉淀，再跑胶
只有一点smear，所以现在确定那是蛋白+核酸在孔里；为什么同样的master mix做别的
P |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 提取天然产物很毒啊，天天跑柱子，氯仿甲醇当水用的。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 270nm是phenol的峰，应该是你的phenol没有除干净。phenol extraction之后用氯仿再
提一次，然后再做ethanol precipitation。做ethanol precipitation的时候，用95%
的乙醇比用100%的乙醇要好。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 多谢啦！你干脆到我们lab来做吧，我们一帮土人每天自己瞎折腾，郁闷啊~
我用PLG column，还以为可以省了氯仿这一步呢，被欺骗了。。。你说95％ vs 100
％是指沉淀那一步？不太明白为什么会有区别。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 你们招人么？我刚被我第一次面试的PI糗了一通，说我达不到他的要求还敢要H1B，让
我再表一下忠心他才考虑要不要招我，郁闷透了。说 If you are still seriously
interested in the postdoc position in my laboratory, please tell me why I
should revise my concerns listed above. 简直了。。。
做phenol extraction，氯仿这一步是不能省的，否则除不干净phenol。
乙醇蒸馏是和水共蒸馏的，最纯只能达到95%。工业上制备100%纯酒精是要在95%的基础
上再除水的，我忘了是怎么除了，反正依稀记得说是最后出来的纯酒精里，会有痕量的
苯。一般如果用做溶剂没什么问题，可是如果用来做DNA沉淀的话，如果酒精的质量不
过关，反而会影响后续的实验。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 7 我不直接回答你的问题，只是提供一个貌似更好的、而且可行的方案。
与其用trizol，加什么氯仿、异丙醇，最后是乙醇这么多步骤，不如用RNAzol一步完成
。pipette的时候，不用担心多吸会有下层液体的污染。因为rnazol根本没有液体分层。
不管用那种试剂，你这种从活体组织提取rna的情况，根本用不着100mg。尤其象肝脏。
有两三粒芝麻大小的组织就完全可以了。当然，还是用1ml试剂比较稳妥。
另外，在加异丙醇（或者别的醇）沉淀rna的时候，不一定按照说明那样离心。可以采
取小一些转速。这样出来的pellet比较松。用酒精洗就会洗得干净。最后溶解的时候也
更容易。不用担心低转速会导致低收获量。你有足够的样品，不存在收获量低的问题。
只要动作快，不用担心常温、低温。比如用rnazol，从匀浆化到形成rna沉淀pellet，
不超过20分钟。从头至尾都有保护：试剂可以保护溶解状态rna不受降解，沉淀状态的
rna也不容易降解。
为了提高匀浆化效率，可采用sonication。10秒钟可以完全打散任何组织。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 没什么特别要注意的
无非是不要vortex
混匀的步骤要温柔
不要用枪反复吹吸
之类的
反正要扩大的片段的话最好手工提
CTAB（optional，取决于你的实验对象），酚氯仿，isopropanol沉淀
最后RNase A处理
不要用kit
kit提出来的对于小片段复制还行
大了就可能不行了 |
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f**u
发帖数: 346 | 9 我也很喜欢那个化学家，看上去像是真正的学者。
对于那个第一作者，我觉得学术界的人恐怕对她会有看法，
但不可否认她的表演也许对公众和那些议员真的挺有用的。
至于你说的同位素标记，我可没你那么乐观，如果你去看看她的method，可能会有同感。
她纯化DNA的方法是细胞pellet裂解之后用酚氯仿多次抽提，然后水项用乙醇沉淀。
得到的DNA pellet都没说用70%酒精洗一遍就用buffer溶解了，然后溶液直接测放射性。
就算用70%酒精洗了一遍，最后得到的DNA里面也会有微量的盐污染。
我没有定量算过他们加到培养基里的放射强度和最后测到的放射强度间的关系，
有兴趣的朋友们可以自己算算。
最大的问题是她们没有阴性对照，不知道背景会有多大。
P |
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V******9
发帖数: 1281 | 10 【 以下文字转载自 NewYork 讨论区 】
发信人: liulinglll (liuliu), 信区: NewYork
标 题: 转 生物男们，来看看北美化学猛男 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 9 23:40:50 2010, 美东)
发信人: henryjing (little13), 信区: PhotoGear
标 题: 转 生物男们，来看看北美化学猛男
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 9 23:33:00 2010, 美东)
我是一名猛男，一名化学猛男。猛男不一定都学化学，但学化学的一定都是猛男。
猛男做实验，不穿白袍，不着goggle, 不戴手套，更不用面罩。我哥们做试验烧
瓶爆炸，划破胳膊，人现在是KC Nicolaou的看家高徒。我师兄蒸馏双氧水爆炸，
连门带人迸出走廊，人现在是百人计划。我师傅把乙醚搁在烤箱上着火，把脸烧
烂，人现在是长江学者。这些都是大猛。我只是小猛，排不上百人，够不上长江，
人要聘我做芙蓉学者，我想想芙蓉姐姐，还是坚持没去。
高中我就发现，硝酸银沾到皮肤上，两天后就会变黑。现在我还没事就点两颗美
... 阅读全帖 |
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d*******z
发帖数: 212 | 11 我是一名猛男，一名生物猛男。猛男不一定都学生物，但学生物的一定都是猛男。
生物猛男，就是做实验不戴手套，不穿白大褂，不戴口罩，不戴护目镜。
琼脂糖胶其实和水果冻是一样的，EB也没什么可怕，有一次我把EB沾在了手指上
，成屎黄色，我就当它是美年达了。
液氮也没有那么冷，我曾经被液氮冻一下也就是皮肉发白，省得买面膜和化妆品
了，大宝SOD都是浮云，超氧化物岐化酶算什么，玉米幼芽中也有SOD的，我曾经把它涂
在脸上，美白效果还真不如液氮。对了，我在实践中发现，原来单物质也是可以做炸弹
的，国产劣质EP管，放上液氮，可以当摔炮使用，不会污染空气，比较环保。
CTAB的名字很长，沾一点也不会有事，SDS我曾经把它叫做SBS，就是SB的复数形
式。氯仿异戊醇味道很刺激，有点初恋的感觉，加点苯酚就更完美了。
丙烯酰胺能毒害我的神经，但毒害不了我猛男的精神。TEMED闻起来和皮蛋的味
道是一样的，自从做了生物猛男之后，我就开始讨厌吃皮蛋。拥有了考马氏亮蓝，就可
以变身为阿凡达。硝酸银会使你的皮肤发黑，我曾经多次与硝酸银发生亲密接触，把我
原来... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 12 这个东东不是跟氯仿差不多嘛?
）我在加州，一张塌塌米床是1200刀。
fumigation， 用的是：
全部用这个东西来消毒/杀虫，包括苹果这类的食物。
宝宝，可能也会经常在床上玩。我本来的想法是以后这张床可以给宝宝睡，因为小孩子
睡硬床比较好。 |
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l***d
发帖数: 1828 | 13 http://www.dfdaily.com/html/8755/2011/5/14/604774.shtml
作者 李福洋 来源:东方早报
DNA 储存在细胞核内，生物体在死亡过程中，细胞会逐渐发生自溶，大量酶类如蛋白酶
、DNA酶等释放，细胞的DNA很快会被降解，即便是细胞没来得及自溶，但是天长日久，
微生物进驻组织或细胞，就像寄居蟹一样，在那里吃喝拉撒、生老病死，它们产生的酶
类也会把原细胞内的DNA破坏掉，一般死亡的动物和人的遗体，DNA很难完整保存下来。
最终技术的进步打破了这个咒语，研究人员成功地获得图坦卡蒙的DNA，也成功地得到
了各个木乃伊的DNA指纹图谱。
古埃及法老（国王）的尸体都被做成木乃伊，保存在金字塔里，据传说，冒犯了法老王
的干尸，就会中法老的咒语。在美国电影的渲染下，这个咒语被传得充满玄机，神秘莫
测。似乎在埃及北部第六代塞加拉王朝的法老墓外，或内侧出现类似“咒语”的文字，
据说也只是针对祭司的，好让其尽职保护墓地，而非防盗墓贼设定的神秘“咒语”或机
关。考古学家其实并未在法老墓内发现任何咒语。
既然法老的咒语不一定有，那也就不存在打破一说。不过，法老... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 14 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
pyrsequencing检测甲基化程度。
问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
谢谢！ |
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W*********n
发帖数: 775 | 16 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？
谢谢! |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。
最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 组织量太大太脏，直接genotyping不成
于是抽提
沉淀不出像样的genomic DNA了，看起来像是提了一堆fragment出来 |
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m******5
发帖数: 1383 | 22 那个老鼠已经被折腾得够呛了……不想再刺激它了…… |
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z*t
发帖数: 863 | 24 屠的“青蒿”提取物在临床试验差点因为心脏毒性被毙,黄花蒿（中医正品讲的臭蒿）
其实救了这个药，山东和云南的大夫还有植物学家们有他们的功劳。
（这个问题造成了后来山东和云南对屠首功的异议，认为她没有正确辨认植物，正品青
蒿实际没有抗疟作用。预实验的成功可能是正品青蒿掺入黄花蒿的后的结果）。还有悲
剧的中药常山，是中医最常用的抗疟药，但因为毒性一直无法使用。。。
Lasker奖颁给屠是对她贡献的肯定，不过更多在她Lasker光环背后的人的故事一样精彩
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原帖地址
http://www.cchere.com/article/2064202
http://www.cchere.com/article/2064221
由带疟原虫的蚊子传播的疟疾是世界上最严重的传染病之一，直到今天全球仍有20亿人
生活在疟疾高发地区——非洲，东南亚，南亚和南美。每年大约有2亿人被感染，100多
万人因此丧命，主要是孕妇和5岁以下儿童。目前治疗疟疾的最有效的药物之一就是中
国在七十年代研制的青蒿素，这也是建国后中国医药界最重要的成果。
青蒿素的研究发端于六十年代越南战争... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 76 | 25 http://blog.sina.com.cn/s/blog_523618b40100a1wi.html
青蒿素的昨天和今天 ——记云南药物研究所对青蒿素研究的贡献
原云南药物研究所523研究组成员罗泽渊
在云南药物研究所建所50周年之际，我很高兴能回来参加庆典，并应朱兆云所长之邀，
要我作一个有关青蒿素昨天、今天和明天的命题发言，和青年同事们谈谈青蒿素的故事
。说来惭愧，自从我们调离云南省药物研究所，我就离开了有关青蒿素的一切研究，尽
管心中永远存在着一个青蒿素的情结，但对它的今天我已知之甚少，对它的明天更不敢
妄谈了，因此只能谈谈它的昨天，让我们今天的云南药物研究所的青年一代了解这一段
不平凡的历史。
一、523任务的历史背景
20世纪60年代中期，印度支那战争升级。为了支援越南抗美救国战争，毛主席、周总理
指示有关部门“把解决热带地区部队作战中遭受疟疾侵害、严重影响战斗力的问题”作
为一项紧急战备援外任务。青蒿素就是在这一特殊历史背景下诞生的。它是军队和地方
的科研、生产、临床单位共同努力、协同作战取得的重大成果，是我国在特殊历史条件
下，由全国60多个科研单位，500多名科研人... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 26
2/
这位战友用不着惊讶，因为我们实验室很少handle genomic DNA，所以你说的那些kit
我们确实没有，这次我只有两个sample，就想用传统的蛋白酶K消化酚氯仿抽提得了，
以前做过组织的，现在是培养的贴壁细胞，处理上应该有点差别，而且样品比较宝贵，
所以想搞个可靠地protocol，kit就不考虑了。老板虽然钱不多，但是该买的东西从来
不眨眼的，不过为了两管DNA还要去买个kit，我自己都不好意思开口啊。
另外，有谁知道TNE buffer的配方不？我们组之前的posdoc一直用这个buffer+蛋白酶K
消化细胞，然后直接加饱和氯化钠，离心取上清后用乙醇沉淀。不过最近这个buffer找
不到了，她也没留下配方，网上找了几个貌似差别还蛮大，谁用过的，确实可靠的，甩
一个给我吧，谢了。 |
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h******y
发帖数: 55 | 27 mini kit 可以啊。碱法用酚氯仿抽下做transfection都可以。
要包子！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 28 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
教大家，
1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
EDTA而直接做heat inactivation？
请大家帮助，谢谢 |
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w******n
发帖数: 767 | 29 哈，我遇到过，提小鼠肝脏RNA,最后有一大坨白色的，溶不了。解决方法请按照TRIZOL
说明书严格操作。
1.裂解要充分，悬液要透明，看不到没溶的组织。
2.氯仿抽提离心时间要足够。
3.4度离心。
最后得到RNA应该是速溶的。 |
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I***a
发帖数: 13467 | 30 2.氯仿抽提离心时间要足够。
－－－－－一般多长时间啊？ |
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h****k
发帖数: 182 | 31 感谢楼上各位，看了下详细的protocol，RLM需要处理RNA很多次，还用到了氯仿沉淀，
对第一次做RACE的来说好复杂。Clontech的看起来简单些。不知道实际操作中哪个效果
好。基因大概2KB，丰度应该不低 |
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i*S
发帖数: 175 | 32 我用的Pierce卖的梯度胶，然后sypro ruby染色。图是用机器扫出来的。用肉眼在
transilluminator上看也差不多。
能看见条带，可是lane里面背景太高，很不分明。特别是边缘像是smear了。请问大家
有没有什么主意？
我开始认为跑之前我没desalting，溶液里Na+ 和 Ka+ 大概都约500mM，有些高了，蛋
白分离的不好，于是用氯仿提纯了一下，好像没什么帮助啊……
PS: 下方黑块是怎么回事我也不清楚嗯 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 你简直是在提取genomic DNA 吧 啊?
50 kbp length 以上的Gel picture 白的亮眼球的 都是 Genomic DNA
氯仿or 意丙醇抽提的话 接近界面的 界面附近液层的 移液枪的chip 尖端 不得在碰到那个位置的时侯
有丝毫的吸液的大拇指的松动的动作
酒精沉淀 以及清洗的分离液体作业的时候 同样
好的RNA Extraction PP 如下:
[回复]
[ 5 ]
发信人: contain (containor), 信区: Biology
标 题: Re: 还是RT_PCR
发信站: BBS 未名空间站 (Thu May 24 22:06:11 2012, 美东)
RT之前为什么一定要用dnase处理？我现在的问题不是有DNA污染，而是RT-PCR之后什么
产物都没看到。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 34 居然还引用那篇Nature news.
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体育毒瘤:兴奋剂检测的驴车远赶不上研发的火箭(图)
文章来源: 网易 于 2012-08-03 14:58:30 - 新闻取自各大新闻媒体，新闻内容并不代
表本网立场！
打印本新闻 (被阅读 918 次)
导 语
迄今为止，在兴奋剂和兴奋剂检测的竞赛中，检测全面落于下风。而在可预期的将来，
随着更多的技术应用，面对新型兴奋剂，检测的劣势还会进一步扩大。
兴奋剂是现代奥运会都要严加防范的。本届奥运会也一样，这次伦敦奥运坏被称为对兴
奋剂检测最严的奥运会。共有150名专家和1000名专业人员参与到检测当中，可以检测
出240多种违禁物质。虽然武装到了牙齿，但不得不为世界反兴奋剂组织泼上一喷冷水
，因为伦敦看似严不透风的兴奋剂检测其实也只是马后炮。
兴奋剂有超过2500年历史，期间一度被当做提高运动成绩的良方
和只有几十年历史的兴奋剂检测不一样，兴奋剂并不是新鲜的东西：人类在运... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 Thx, Cosimo2014
5 Ys ago her web 1.0 verson about 给Bio 本科生进Bio实验室的一些建议
发信人: nyouyou (BIR), 信区: LifeScience
标 题: 给本科生进实验室的一些建议
发信站: 水木社区 (Mon Nov 5 02:12:18 2007), 站内
我曾经是DBSB的本科生，大二暑假进了一个实验室，课题听着有意思，但条件不成熟，
做不下去，只记住了氯仿抽提，也没真正动手。
below ignored
pls go to
HTTP : //bbs.sysu.edu.cn/bbstcon?board=LS&file=M.1194368384.A
考古买买提 Bio分舵 下 即可:
http://www.mitbbs.com/article_t/ECUST/31173733.html |
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b******s
发帖数: 1089 | 36 Kit好用，但是很贵。一个盒子里没几个柱子。
我要做BIFC，有很多组合，需要提很多plasmids。想自己提纯。网上搜了一些protocol
，基本上都是盐沉淀之后酚氯仿纯化。试过发现转染效率都极低。我用的系统是植物的
protoplasts，有实验室用CsCL离心效果很好。想问问有没有更清洁安全的protocol？
谢谢 |
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q*********a
发帖数: 300 | 37 看了好多版上同学分享自己化学和化工从业的经历，在这里也把自己的经历和了解的一
些信息写出来，希望对还在这个行业里奋斗的我们有所帮助。帖子里面会有一些涉及个
人的信息，希望大家别人肉我。如果感兴趣想聊天，可以站内信或者linkedin我。
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有一个定论听得太多了，一定要站出来反驳下。经常有人说XX公司不招没绿卡的，问过
了HR不招没绿卡的。我的直接认识是，这都是人事部门的规定，但是每年都有特例，就
拿最近版上讨论的比较多的XX公司来说。只有去年因为特殊情况没有招foreign
employee之外，每年都有sponsor H1b，LCA，具体数据可以去my visa job上查。一般
这种情况下你看到一个很适合你的职位，不要灰心。准备好简历，presentation，动用
一切可以动用的networking找到HM。如果HM觉得你适合的话，公司规定是可以破例的。
如果Y公司从来没有sponsor过h1b，是不是就没机会了呢？当然也不是，只要你是他需
要的人也都会有破例的。这种事情经常发生，有太多人被所谓的规则挡在门外了，草草
投个简历了事。其实只有自己... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 351 | 38 先用Trizol抽提RNA，加氯仿分层后，取水相，向其中加等量乙醇，然后过RNAeasy的柱
子。方便简单，无DNA污染。
啊？ |
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m******e
发帖数: 459 | 39 关于基因组DNA抽提纯化，用Qiagen的kit当然得率更高，纯度更高，但成本也高。我对
哺乳动物或者植物基因组提取没有经验，但是从酵母细胞中提取基因组我一般都是手提
，用异丙醇沉淀粗提基因组的上清，用TE溶解沉淀后加RNAse（确保没有DNAse污染）处
理，然后用酚氯仿抽替两次除去RNAse和残留的nuclease，最后加乙醇沉淀后测吸光值
定量。
关于探针克隆后测序，我觉得主要是确保序列是你想要的探针片段，因为不能排除直接
从基因组扩增出来的非特异片段正好跟你的探针大小一样。
关于探针突变的问题，如果你用末端标记法标记探针，PCR引入的点突变可能会有影响
，但是如果你是用切口平移法或者最常用的随机引物标记法，那么影响基本可以忽略。
我只用过随机引物标记地高辛和磷32,用普通taq酶做PCR完全没问题。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 41
非常感谢！你说的那个先RNA后protein的方法我是知道的，但是我不想因为RNA提取过
程中给protein引入其他的杂质，比如残留的酚氯仿什么的。 |
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s******y
发帖数: 17729 | 42 看了你上面说是做植物的，如果经常提DNA，酚氯仿那些有机溶剂才是要注意悠着点。
还有如果要跑变性胶，甲醛一定要当心。反正挥发性强的有机溶剂杀伤力很大。 |
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n********e
发帖数: 72 | 43 多虑了。戴着手套，操作时手脚干净点。那味道是琼脂糖胶的味道。比起溴化乙锭，你
应该更关注那些有机溶剂的毒性，比如氯仿等，那些才是真正直接损害健康的东西。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 44 room temperature? Should be clear
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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L****e
发帖数: 499 | 45 正好我也遇到过这个问题，我觉得还是你的甲醇和录放的质量有问题，可能是在实验室
放久了，吸了水，如果可能的还是去买新的吧，但是如果你将配好的2;1的溶液放几天
的话，它又会变clear了。我刚开始提lipid 是在冬天，天气很干燥，一切顺利，可是
到了第二年春天开始，提取时总出问题，最后提出来的lipid 用N2吹干的时候，刚开始
还是清的，到要干的时候就变混浊了，很难吹干，那应该就是水份，所以我估计是到了
春天空气湿度很大，试剂也很容易吸水。
我交你一个绝招就是提取的lipid放在冰箱中冻一夜，第二天拿出来时候你就会发现最
上面漂着一层水滴，将水滴吸掉，就是在纯有机溶剂中的lipid了 |
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q*t
发帖数: 61 | 48 Do not use plastic pipettes or containers. Measure out Chloroform in glass
pipette or glass cylinder and store solution in a glass bottle. Chloroform
melts plastic, which causes the precipitation in this solution.
楼主知道标准曲线的线性方程式怎么做吗，谢了！ |
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j****n
发帖数: 3370 | 49 room temperature? Should be clear
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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