s******y
发帖数: 28562 | 1 一般来说。。。如果纯蛋白能溶的话，一般都是折叠正确了的。
当然也有例外。比方说如果带电量很强的话，有时候会出现所谓的soluble aggregate
，就是单独的情况下能溶解，但是一碰到什么核心立刻就纠缠起来沉了。
你这个情况听起来有点象这个情况。
既然你说了A蛋白用GST-bead的话会导致迅速aggregate, 你是否试验过把B蛋白先
cross-link 在什么bead 上，然后去结合低浓度的纯化之后的A? |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 2 我可能没说清楚
GST-A蛋白如果用GST resin的话是可以纯化,并且浓缩的
我是说如果GST-A,B共表达,用GST的magnetic beads做in vitro pull-down
上吸铁石,
很快beads变成一整片
没有办法吸吹
我不能说是A或者A+B aggregate了
是bead变成一整片无法分开
当然具体什么原因我不知道
aggregate |
|
s******y
发帖数: 28562 | 3 应该就是Aggregate, 导致带有那些蛋白的bead被胶结到一起了。
如果你的两个蛋白分别表达的时候都可溶而且能够纯化得到纯体的话，
要研究复合体的时候就只好用低浓度溶液，或者用semi solid phase 了。 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 4 Blue Native gel可行否？
如果你试了低浓度混合没有发现明显沉淀的话，你可以进一步用ultrafiltration浓缩
一下，但具体能浓缩到什么程度就不知道了，你得trial and error一番。
A和B是用同一种purification tag吗？如果不同的话，你可以试试在混合后纯化那个比
例少的，假如AB complex比较稳定的话。
DLS也需要一定浓度才能准确，如果浓度太低可能不一定准确。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 5 有，按照序列的分析有分成大概3个“domain”
（可能说region更准确一点，因为结构未知）
也做过1,2,3,12,23,123这样分别表达纯化这样一系列的试验。。。。
Aggregrate |
|
e**e
发帖数: 166 | 6 谢谢你的答复
我的蛋白复合体是植物组织中提取的天然蛋白。 我测到其中的一个糖基转移酶活性很
高，所以想纯化出来做proteomics. 我的设想是cell lysate 做盐析，然后过sec gel
filtration
最后做离子交换柱。 请问你有什么好的建议吗？
谢谢 |
|
e****s
发帖数: 1125 | 7 你的复合物是什么概念，会这么稳定？！
比如离子柱要用高盐洗脱，高盐会不会破坏你的复合物呢？
Anyway,如果是分子筛+离子的话，我会先试离子柱子，然后分子筛。
离子柱子有很好的浓缩作用，如果盐析没有对纯度有太大帮助的化，直接上离子柱子。
反过来，分子筛比较时候最后的精细纯化。你的样品体积不能太大，量不能太高。所以
，分子筛不适合当第一个柱子，样品太脏。
gel |
|
s*******e
发帖数: 1010 | 8 估计人家想问的是怎么不用detergent就纯化到了膜蛋白，潜台词是你怎么保证膜蛋白
在无detergent体系中保留了正常功能和天然构象。 |
|
q******g
发帖数: 3858 | 9 做MS时， 是否能看到脂类的峰呢？ 或者有什么脂的标记物， 可以证明你的蛋白是和
膜上的脂一起洗脱下来。或者找个文献，看看是否有人用类似的方法纯化出膜蛋白。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 10 纯化的蛋白看起来好像跟DnaJ结合成了complex
Gel Filtration上单峰洗脱
下来是目标蛋白还有DnaJ (~37 kDa)
有没有什么trick可以去除DnaJ?
先谢过 |
|
|
c*********r
发帖数: 1046 | 12 要纯化一个Rat IgG2b的蛋白， 要用 protein L resin, 那家公司的好， 请用过的TX
推荐一下， 谢谢。送包子！ |
|
j*****q
发帖数: 82 | 13 提供200mg以下单克隆抗体，融合蛋白以及其他重组蛋白在CHO/HEK 293里瞬时表达蛋白
和纯化的服务。提供关于纯度，浓度，内毒，ID等其他可以订制的表征服务。
这样的服务大家有需要吗？
需要的请PM详谈。
谢谢 |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 14 超四十以上的，我都page。刚作一个单aa突变，四十的primer pair,page纯化，居然
seq四个克隆，就找到一个miss了一个Nt的。 |
|
f**********s
发帖数: 1415 | 15 分离细胞核后，想用denature immunoprecipitation纯化一种可溶性核蛋白，包子求一
个lysis buffer配方和protocol. Thanks. |
|
b*******e
发帖数: 567 | 16 手头已有小鼠单克隆抗体的hybridoma cell line. 现在需要纯化出至少200mg的单抗用
来打小鼠模型做therapy研究。大家有啥廉价、高效的large-scale提纯单抗的方法吗？
多谢赐教！ |
|
d****i
发帖数: 2346 | 17 感谢两位！如果用杂交瘤细胞接种小鼠生产腹水是不是抗体浓度会更高？纯化起来是不
是更方便？ |
|
|
o****u
发帖数: 214 | 19 基本同意。发酵和纯化是两种完全不同的技能。欧美的大学里面是没有大反应器的。这
样的人要到公司里面去招。即使20W也不一定能招到两种都懂的人。因为公司里面也没
有这样的全能培养体系，都是专职专用的。
到是国内的学校有大规模发酵设备的很多。不要说几百升的小打小闹，上万升的也有。
发酵的话，江南大学是做的最好的。提纯的话，去北化看看有没有人吧。大规模做的话
，KNOW-HOW的东西很多。原理谁都懂，能同时做好两件事的人可能真的不多。上下游能
通吃的，都自己做老板了，哪里还可能去给别人打工呢？ |
|
e**e
发帖数: 16 | 20 从经验，质量和信誉角度看，国内哪家生物公司比较值得信赖？有朋友知道吗？
目的是在CHO里表达纯化一些蛋白。
谢谢。 |
|
b*****n
发帖数: 1841 | 21 一个转基因白鼠是CD1,一个是黑鼠B6，双转基因后代一直跟B6配，公认的一般纯化多少
代后可以做实验，littermates可以比较公平地做表型比较？ |
|
g*****x
发帖数: 3283 | 22 那样的话我猜蛋白数量应该不算太多？
先试试直接digest然后SPE纯化一下peptide做质谱 |
|
m**n
发帖数: 206 | 23 Elsvier新杂志 Heliyon
文章是讲针对pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugate vaccine开
发的纯化方法
感兴趣的同学请把你的工作学习背景还有电子邮件私信给我吧 |
|
m****m
发帖数: 395 | 24 求审稿机会，膜蛋白、不可溶性蛋白、可溶性蛋白，X射线晶体衍射、核磁共振，结构
生物学、蛋白结构与功能、蛋白表达和纯化技术
站内联系，多谢！！
邮箱： [email protected]/* */ |
|
x*****g
发帖数: 82 | 25 问题1： MALDI-TOF发现单一的产物峰M+122（DMAP分子量），怎么解释？
问题2： 柱层析产品核磁总是有DCC的存在，如何继续纯化？ |
|
s**********e
发帖数: 2888 | 26 是不是变成fatty acid ester之后会容易纯化一点？
我现在做的两个fatty acid isomers的混合物，结构差异很小，一个是一个primary
alcohol，一个是secondary alcohol，有没有什么化学反应可以区分的？
因为需要大量的分离，所以虽然HPLC可以实现，但是还是想找到尽量简单的方法。
谢谢 |
|
y***k
发帖数: 57 | 27 各位老大：
能否用分子筛纯化环氧乙烷除去环氧乙烷中的醛类杂质。
谢谢 |
|
h********g
发帖数: 143 | 28 各位大牛，小弟先拜谢了
最近在做纯化m-phenylenediamine，这种东西买来是黑色的固体，纯的应该是白色固体。
查了些文献，只是很简单的说recrystalization from benzene or DCM，可是我试了，
得到的只是黑色的solution。
也有说distillation，然后recrystalization from EtOH的。我distill后得到的是无
色液体，而且和EtOH会混溶诶...
郁闷屎了....
各位大牛请赐教啊！！！ |
|
h*******n
发帖数: 1328 | 29 说得对，EDC不光是效率低，选择EDC实在不是好的方案。
它自己反应前反应后和产物都是水溶性的，当然你不好纯化了。
不过既然分子量只有900，过根柱子好了 |
|
h******g
发帖数: 600 | 30 文献上讲用ultrafiltration纯化，是不是需要特殊的仪器，还是跟dialysis一样？
谢谢了。 |
|
S*****n
发帖数: 6055 | 31 我们最近投了篇paper，文章的亮点之一就是claim我们的催化剂比较容易除去。
结果审稿人的意见是，催化剂除掉除不掉不重要，碳管纯化最重要的是把amorphous
and graphitic carbon除掉
不知道大家如何看这个问题？ |
|
g******2
发帖数: 64 | 32 来自主题: Pharmaceutical版 - 蛋白表达纯化 不是在美国拿的博士学位， 现在在美国做博士后第二年，做的是蛋白结构相关的课题
。 对蛋白表达纯化， 分子克隆很熟。 最近一直在找相关的公共， 没有一点消息，
想在这里问问， 有没有人愿意推荐一下。 |
|
s********s
发帖数: 579 | 33 来自主题: Pharmaceutical版 - 蛋白表达纯化 回国吧,不少公司都需要.
蛋白的表达和纯化现在都外包到中国啦 |
|
|
|
s******e
发帖数: 1073 | 36 只用IEX或HIC for purification, 能快速纯化吗？
已经在用这种方法了还是正在考虑阶段 |
|
m**n
发帖数: 206 | 37 Elsvier新杂志 Heliyon
文章是讲针对pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugate vaccine开
发的纯化方法
感兴趣的同学请把你的工作学习背景还有电子邮件私信给我吧 |
|
a*m
发帖数: 1217 | 38 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: snowboard (lucky), 信区: Biology
标 题: 超速离心来纯化病毒的pellet的溶解问题
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Aug 1 11:16:02 2009, 美东)
用sucrose cushion超速离心打下来的病毒,怎么好象很难完全重新溶解.
我第二次溶解,还有很多甚至更多于第一次的溶解下来的量.
我用的ultra clear的管子.会和病毒有专门的吸附力吗?
现在我都做两次,时间太长了.大家都怎么做? 谢谢. |
|
a*m
发帖数: 1217 | 39 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: snowboard (lucky), 信区: Biology
标 题: 超速离心来纯化病毒的pellet的溶解问题
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Aug 1 11:16:02 2009, 美东)
用sucrose cushion超速离心打下来的病毒,怎么好象很难完全重新溶解.
我第二次溶解,还有很多甚至更多于第一次的溶解下来的量.
我用的ultra clear的管子.会和病毒有专门的吸附力吗?
现在我都做两次,时间太长了.大家都怎么做? 谢谢. |
|
|
a*****x
发帖数: 901 | 41 三分之一
Chris Miller 认为, 记录不到ClC-ec1单通道电流的原因可能有两个, 一个是电流被其
他杂质蛋白通过的电流遮盖住了. 另一个原因可能是电流实在太小或者出现时间太短了
, 以至于仪器灵敏度不够, 记录不到. (还有一个提到的可能性是所用的ClC-ec1蛋白大
多失活了, 不过很早就被实验排除了, 因为这些蛋白可以通过同位素标记过的氯离子,
这里就不详述了)
先来解决杂质蛋白的问题. Chris Miller记录的是通过纯化过的蛋白的电流. 想想看
ClC-ec1已经可以纯化到的结晶的程度了, 难道还会有杂质吗? 的确, 纯化过的ClC-ec1
已经很纯了, 99.9%量级, 电泳绝对是一条带...可惜, 用来记录单通道电流还是不够纯
. 可见单通道电流记录无愧是生物技术精密之颠峰. Chris Miller发现, E. Coli中的
porin孔蛋白有少量污染到了纯化的ClC-ec1. 而porin可以通过巨大的电流, 影响ClC-
ec1的记录. 所以Chris Miller首先做的, 就是通过纯化去处杂质porin.
花了很多money和time去除了por... 阅读全帖 |
|
a***s
发帖数: 21 | 42 如下是产品介绍，请版上高人看看是否可靠。谢谢！
http://www.chinagene.com/healthmore.asp?cpfl=1010&id=183
依托“家蚕生物反应器”技术研发的“美基美态”是利用人类基因在体外截取，与
家蚕杆状病毒进行重组，使人类基因保留自己的生理功能和活性，然后在中试实验室复
制成母液，接种于“家蚕生物反应器”中转录培养，运用先进的生物技术进行包裹制成
的口服生物制剂，可补充人体免疫系统所需的“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”，全
面恢复人体免疫力！
通过“家蚕生物反应器”技术生产的高科技生物制剂“美基美态”掌握了当今生
物科技的核心技术，是中华民族的骄傲。
“美基美态”胶囊富含“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”，抗菌肽和溶菌酶等
活力DNA成分及天然活性蛋白，因含有人类基因片段，可直接被人体吸收利用，能迅速
激活人体免疫系统，修复人体受损细胞，延缓机体衰老。
【规格】200mg/粒x45粒/瓶x2瓶/盒
【食用量及食用方法】每日3次，每次1粒
【美基美态】独有的四大作用
（一）免疫系统发动机，壮... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 43 第五篇 Tag! You’re it.
这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
每个蛋白都有自己的脾气，所以表达和纯化他们其实就有点像cooking，从原材料的准
备，配方到调味，把握火候，最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传，心里笑一下，
然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
效表达， 只是都在包涵体里。从另一方面来讲，如果没有时间和经费的限制，确实每
一个蛋白只要花功夫去做，最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
大部分人的时间和经费都有限，也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨， 那么就
有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸，它的
imidazole side chain的pKa在6左右，这个特性让Histidine成为很多酶的活性中心的
一个重要组分， 这方面这次就不多讲了；另一方面，histidine也是个很好的metal
chelator， 是很多metallop... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 44 1931年11月7日，瑞金，苏区中央局部分委员合影，右二为时任中央局代理书记的毛泽
东。
距今69年前（本文发表于1999年——编注），一场大规模的革命恐怖浪潮席卷中共领导
的江西苏区。在一轮名曰“肃AB团”的大清洗中，几千名红军官兵和根据地内的党团员
及普通群众惨遭杀害[1]。干此事的并非中共的死敌——蒋介石和国民党，而是根据地
的中共党组织和由毛泽东亲自指挥的红一方面军总前委。这段史实以后随着毛泽东在中
共党内地位的上升被完全改写。直至80-90年代，在撇开毛的个人责任的前提下，当年
这场事件的大致轮廓才初步显现，但仍有许多晦暗不明之处。本文所要研究的是：毛泽
东为何要在红军和根据地内发起“打AB团”？毛为大清洗寻找的依据是什么？大恐怖与
建立新社会有什么关系？为什么毛在掌握中共实权后不再采用“打AB团”的方式解决党
内矛盾？
事件的起因：以暴力维护领导权威
毛泽东在中国共产革命运动中声誉鹊起始于1927年国共分裂后，最先走上武装反抗国民
党的道路，从此成为中共武装革命的著名领导人。在这之前，毛虽是中共建党元老之一
，但是在1921-27年，党的声光全被陈独秀等所占，尽管毛被公认为... 阅读全帖 |
|
w*********g
发帖数: 30882 | 45 同时质问金龙鱼：
（1）你们对自己加工抗草甘膦转基因大豆生产的金龙鱼转基因大豆油，是否对孟山
都抗草甘膦转基因大豆中必然存在的活的转基因片段进行了检测？
（2）如果进行了检测的话，检测的结果如何？为什么不向消费者告知来自抗草甘膦
转基因大豆的这种转基因片段对人类健康，特别对青少年、儿童、婴儿与孕妇及其胎儿
，造成一系列危害？
陈一文：转基因大豆脂肪酸含量比非转基因大豆的低不利健康
http://blog.sina.com.cn/s/blog_4bb17e9d0102dr56.html
国内学者检测发现：抗草甘膦转基因大豆的脂肪酸含量比非转基因大豆的低。食用
油脂的营养价值较大程度是取决于它的脂肪酸组成及其配比。中国优质非转基因传统大
豆油ω-6和ω-3脂肪酸的含量都较高。国外学者发现：抗草甘膦转基因大豆大量施用草
甘膦导致转基因大豆ω-6和ω-3脂肪酸的含量下降，对健康不利！深圳市计量质量检测
研究院对金龙鱼转基因大豆油的脂肪酸含量，特别是ω-6和ω-3脂肪酸含量，进行检测
了吗？与中国优质非转基因大豆相比的检测结果如何？
“抗草甘膦转基因大豆的脂肪酸含量比非转... 阅读全帖 |
|
r***u
发帖数: 1272 | 46 2．方法论的转变
要想在科学研究上取得突破和成功，只有时间的付出和刻苦，是不够的。批判性分析（
critical analysis）是必须具备的一种素质。
研究生与本科生最大的区别是：本科生以吸取学习人类积累的知识为主、兼顾科学研究
和技能训练；而博士生的本质是通过科学研究来发掘创造新知识，当前和以往学习的知
识都是为了更好地服务于科学研究。在以学习知识为主的本科生阶段，提出问题固然重
要，但答案往往已经存在，所以问题是否critical没有那么关键。博士生阶段则完全不
同，必须具备critical analysis的能力，否则不可能成为优秀的科学家。这一点，我
称之为方法论的转变。
其实，整个大学和研究生阶段教育的实质就是培养critical analysis的能力，养成能
够进行创新科研的方法论。这里的例子非常多，覆盖的范围也非常广，在此举几个让我
终生难忘的例子。
(1) 正确分析负面结果（negative results）是成功的关键。
作为生命学科的一名博士生，如果每一个实验都很顺利、能得到预料中的正面结果（
positive results），除个别研究领域外，一般只需要... 阅读全帖 |
|
p*****m
发帖数: 7030 | 47 你又错了 你说的和heculase说的八成不是一回事。生化纯化的过程都需要assay 否
则他们纯化什么？而且一般大家都希望简单方便的ASSAY 这样可以节省很多时间 而
且最好这个assay就是all-or-none,方便指导纯化。至于说纯化出来的东西怎么做更
细致的assay去分析功能，那是另一个问题，而且我个人意见这比设计一个简洁高效
的纯化assay容易多了。
比如说吧，检测apoptosis的assay太多了 从形态到细胞学到生化方法，但是XD纯化
cytochrome C的时候用的assay很简单，就是看紫外照射以后那个细胞组分能够激活
caspase的活性。事前来看当然问题多了，谁说caspase的活性就一定是apoptosis的
指标了？这个assay压根就不能反映apoptosis的复杂机制。但是无论如何人家拿到
有意义的蛋白了，后面的问题都不存在。
说这个去加基化酶，如果是我来做这个实验的话，我用的assay肯定非常简单，比如
说，Gurdon的paper提到几个干细胞marker的启动子区会被甲基化/去甲基化 那么最
简单的assay就是purify能够去甲基化这 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 48 理论上说应该没有问题
不过可能要摸条件
我用70-80，还有>100的primer做过regular PCR
不过我用的primer
1.Fwd和Rev差不多等长，Tm接近，
而且priming sequence (for target gene)部分的Tm也接近
2.我用的priming sequence比较长，24-28nts
我觉得你做的时候可能
1.不仅reaction的条件要摸
2.PCR cycle的设定要摸（除了gradient，还有touch down，touch up，3 steps, 2
steps之类的可以试）
3.有可能template也要试,我遇到过用整个plasmid不行，
把target gene的fragment切下来胶纯化以后做模板就没有问题
4.如果一切不顺利，建议reverse primer也设计个长点的
哦对了，还有一点，长的那个primer，最好要订纯化过的
不用HPLC纯化的也要PAGE纯化的
或者订了std desalted的回来自己用PAGE胶纯化一下
越长的primer越有可能5'段少一些（对于>100 nts的primer可能少的是一... 阅读全帖 |
|
W*****o
发帖数: 1780 | 49 某牛人，每天朝九晚五，周末不加班，但文章很多，档次也不错。终于明白人家怎么做
实验的了。
老板和另一大牛合作，克隆新基因，表达纯化蛋白，对方做功能。课题交给该牛人。
牛人上网搜了一下。不去定引物，不去杀老鼠提RNA，直接从公司A定了含该基因的质粒
。第二天收到。纯化测序正确。质粒邮寄公司B.告诉对方用什么细胞表达，要多少纯化
的蛋白，不能有标记什么的。两个月后收到纯化的蛋白和详细实验报告（包括质粒构建
，western，纯化等等）。纯化的蛋白送到学校测试中心C质谱测了一下纯度，浓度，确
定序列正确，寄给合作单位D。两个月之后收到活性试验结果和报告。该牛人写了摘要
和introduction，把公司的结果和合作的结果合在一起。老板修改投稿接收发表。从合
作到文章出来差不多半年。老板和合作方对其赞不绝口。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 50 不光是丢碱基
我遇到过几次5'端连序列都有错的
PAGE纯化不算贵
HPLC纯化才贵
而且PAGE纯化自己做也挺简单的
就是要一个手持的短波UV灯而已
再少也不会有不够用的情况
纯化。PAGE纯化很贵，何况本来长引物产率就不高，纯化后就更少了。 |
|
