s******9
发帖数: 283 | 1 In principal, long template should affect the cluster density. Weird
clusters mean non-circular ones. Standard clusters usually have a round
shape.
Somebody told me 1000bp worked for him, which tells the robustness of this
amplification method. But I guess 1000bp can compromise your data quality. |
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a****d
发帖数: 1919 | 2 准备建一个hESC reporter line, 有几个问题向有经验的大牛们请教。
我准备在目的gene末端插入XFP，那么在HDR之间是否应该这个顺序： last exon(stop
codon removed)-T2A-XFP-UTR？
目前在last exon上面找到了一些sgRNA序列，在stop codon上游大概50-150bp. 请问在
这个距离上double nicking是否可行？
另外选择好了sgRNA后，选择HDR是不是按照double nicking位置向上游选700-1000bp，
然后从last exon(stop codon removed)-T2A-XFP-UTR开始向下游选700-1000bp？没有
其他的特殊要求？
准备donor plasmid时，考虑到很难找到特异的酶切位点去匹配几个不同的片段，这种
几个大片段连接，是不是选择Gibson Assembly Cloning更容易一些？ |
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k******a
发帖数: 2436 | 4 当然可能了。hedge fund加上performance fee好年景超过1000bps很多。
RIA合同往往是0.5-5bps。100B aum 又如何。 |
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g***j
发帖数: 40861 | 5 想把细菌DNA用超声波打碎成1000bp左右 怎么查不到资料怎么设置超声波时间和强度啊 |
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L******e
发帖数: 679 | 6 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
（EGFR）。在第一个exon之前的intron里，设计了好几次引物，还是用PCR-BLAST设计
的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段，测序后根本不是我要的那个基因来的（
EGFR）。最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列
。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
大家碰到过这种问题吗？劳驾给点建议。谢了。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 也问个有关Northern Blot的问题
实验室需要做Northern，但之前没人做过。现在有500-1000bp的被Digoxigenin标记的
Anti-sense RNA探针。有Li-cor Odyssey的远红外检测的仪器。现在想找合适的试剂设
计一下怎么做，和大家讨论讨论。
方案1. 看了一下Roche的那个DIG NORTHERN STARTER KIT，最后用的是anti-
digoxigenin-AP。查了一下Odyssey的Fluorescent Reagent Compatibility，Odyssey
能检测NBT/BCIP，但是可能不能定量。
方案2. 抗体直接找一个Anti--digoxigenin-X，X能被Odyssey检测，比如IRdye，Alexa
680什么的。
方案3. 先找个一抗比如mouse/rabbit anti-Digoxigenin，然后用已有的二抗anti-
mouse/rabbit-IRdye680/800CW来检测，有点像Western blot。
还有个关于灵敏度的问题： |
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m*********7
发帖数: 606 | 8 我认为楼主现在要做的不是如何选择哪个sequence，如何设计primer,而是先确定你现
在使用的组织mRNA或cDNA库里这个蛋白是否有表达，表达的isoform是否如sequence 2
所述，否则的话做的都是无用功。
你首先可以在coding region（最好是两个reporting sequence共有的区域）设计
primer扩增300-500bp的片段。这个片段大小很容易扩增，可以很迅速的告诉你此蛋白
是否在你使用的组织mRNA或cDNA库里有表达，是否可以继续使用该材料进行下一步克隆。
如成功的话，再设计两对primer,分别扩增5'-UTR至coding region, 和coding region
至3'-UTR的片段，同样也是300-500bp,这样可以确认该蛋白是否以你所说的sequence 2
的形式表达。如果是的话，再考虑重新设计primer，PCR条件优化，或者扩增两三个800
-1000bp的片段进行拼接。
如果蛋白coding region有表达，而5'-UTR或3'-UTR的扩增未成功，说明该蛋白是以其
他的isoform存在，你需要做5'-RAC |
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i*********0
发帖数: 915 | 9 我怎么记得做fish一般用500-1000bps做block呀。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 10 是知道的基因，有想法。但是一个基因也很长吧？现在有几个病人要测。病人能活肯定
是heterozygote，再加上一些正常的polymorphism，一般测序不会有问题么？我刚测了
四只老鼠的1000bp的一段序列，觉得很多碱基都不清楚都需要自己再回过头来看，如果
整个基因加上两边一点疑似调控序列都测的话，挨个做pcr再测序再自己拼基因是不是
太费时间了呀？
如果普通seq测下来这个基因要是没有突变怎么办，NGS的话我们可以综合考虑一下。不
知道我这个想法可行不可行。
我们现在想评估一下这个测下来的时间和花费，如果真要做工资成本也要考虑进去，因
为如果普通测序自己拼图我肯定会推掉的。如果NGS我倒是想学一下。到时候出paper随
便吧，我要是有时间就弄个草稿，要是没有时间我共同一作放后边也无所谓。 |
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T*****n
发帖数: 897 | 12 作了一个PCR，本来是预期1000bp的带，但却出现了两条550和750的两条带。这是怎么
回事？还有另外两个片段，用正常捐血者的标本能搞得到预期的带，但开始测病人的样
本，却没有出现任何带。这是怎么回事？谢谢！ |
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T*****n
发帖数: 897 | 13 问题是该出的1000bp带没有出。Thanks. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 454 GS FLX+
● Up to 1000bp
● 99.997% accuracy
● 1M reads, 700bp
0.7 Gbase/day
● Homopolymer issue
● Cost ~$14K for run
● $500K instrument
$20K/Gbase
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or soon later you can try:
Ion Torrent PGM
● Long Reads and Fast
● No optics, CMOS chip sensor
● Uses standard nucleotides
● Up to 300bp reads (going to 400bp)
● >99.5% raw
● >99.999% consensus
● 318 (11M wells) >1Gbase in 3 hours
● 8 Gbase/day possible
● Micron sized well, 22mmx22mm chip
moving to 1 Billion wells per chip
● $700 per run (1 Gbas... 阅读全帖 |
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s****9
发帖数: 932 | 15 in situ的probe一般都在500-1000bp之间，没听说合成这么长的rna probe |
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c**i
发帖数: 265 | 16 ORF1也有很强的kozak的，ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的，应该
不存在readthrough的问题。感觉很纠结。 |
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s******9
发帖数: 283 | 17 1000bp template might turn into some clusters of weird shapes that cannot
pass the filter. |
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C**S
发帖数: 522 | 18 1：没什么解释，就是pcr或者transform的时候突变了。
2：我这儿测序，精确度能到800到1000bp，所以2.5k三个primer就覆盖了。涉及到PCR
的克隆，测序还是需要的，不一定哪里就产生一个突变。
digestion |
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t*****z
发帖数: 1598 | 19 首先，transcription factor指的是蛋白质，不是DNA序列。我想你说的是
transcription factor binding site (TFBS)。
TFBS哪里都可能有，对于一个基因有影响的，通常可以分成两类：增强子（enhancer）
和启动子（promoter），两者的区别是：启动子必须在转录起始位点（TSS）附近，而
增强子的调控作用和它到TSS的距离无关（当然，越远越弱，但不是远了就没作用）。
启动子包含了核心启动子和周边的一些其他TFBS，一般你只要从TSS上数1000bp，下数
500bp，就算基本上肯定包括整个启动子了。
增强子么，上游很远都有可能，甚至在内含子里和下游都有可能。
一般认为编码序列不包含转录调控原件。但是也未必，好像最近有一篇文章说到某个序
列既编码又调控。不过一般而言，编码序列可以无视。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 20 又来请教各位大侠了，
我最近发现对一株细胞做某种处理后，一个基因（暂命名为A）的mRNA和protein都显著
下调，结果已经重复多次。现在推测这种处理因素可能会影响细胞株中A基因的转录，
于是构建了一系列逐渐缩短的启动子报告基因（基于pGL3-basic载体）和renilla载体
一起转染细胞。双荧光素酶报告基因分析发现从转录起始位点上游1000bp处开始，一直
到上游150bp，跟对照处理相比，处理组细胞的报告基因的活性一直都有显著下降。见
图A所示。但是当把所有组的报告基因活性都先被对照组pGL3-promoter的活性
normalise后，统计分析却显示到上游200bp时报告基因的活性就没有差异了。两张
figure都是在grapad prism里面用two way anova做的统计分析，结果却截然不同，这
关系到我接下来具体分析哪一个区域的问题，请大家帮我看看，到底哪一种统计方法更
合理？谢谢 |
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发帖数: 1 | 21 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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b***i
发帖数: 3043 | 22 实测中1000bps还没有出现过问题。不过，32kHz有一些问题，肯定需要研究一下，比如
阻抗匹配什么的。这个系统中的32k就是你说的调制解调的载波。只不过系统中未曾用
过阻抗匹配，而且是总线多负载。
另外，我觉得理论得出奇怪的结论，就是1000Hz的信号的波速是32k的1/8，所以才引出
这么多问题。现在开始怀疑连1000Hz的系统也会有问题了。 |
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