r******g
发帖数: 600 | 1 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
transfection）.
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m****m
发帖数: 395 | 2 提纯蛋白后老发现14KD附近有条杂带，是不是lysozyme啊？我的蛋白有HISTAG的，难道lysozyme没被洗掉吗？按理lysozyme不应该结合Ni柱啊，难道lysozyme粘住我要的蛋白
了？大家说说有没有这种情况？
而我要的蛋白又恰恰在15KD上面一点，结果这两条带离得很近，很奇怪 |
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m********r
发帖数: 124 | 3 Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了，250或者 500的盐都是，我都不好意思上我的胶图
了，我的融合蛋白量（25KD）在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白，但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子，主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的；
GST 我有另一个麻烦，就是free GST很多，摇再多的菌，也有一半以上的GST 结合到
beads上，fusion protein相对结合的少啊，这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换，我还没试。但我想尝试上来就用它，而不是Ni之后。我们没有mono的
，都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊，我在国内的时候
试过，不是很好用。 |
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l****y
发帖数: 398 | 4 想干嘛？考虑一下nanobody吧， 15kd,小小的，fuse个信号肽或者直接和一种什么肽
coincubate,都可能钻进去。 |
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y****6
发帖数: 196 | 5 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azide modified oligo 反应
。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
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y****6
发帖数: 196 | 6 自己顶一下
15kD
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y****6
发帖数: 196 | 7 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azimde modified oligo 反
应。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
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