A****A
发帖数: 16 | 1 实际上，目前大部分证据表明TALEN的off target效应要小于ZFN. TALEN现在的主要缺
点在于size太大，一个TALEN coding sequecne 至少要4kb, 而ZFN则只要1kb左右。而
且从目前以发表的和我们自己的数据来看，TALEN的剪切活性可能要低于ZFN。现在一些
实验室都在进一步优化TALEN的size以及活性，希望以后能有大幅度的提高。TALEN相对
于ZFN目前最大的优势是位点的选择范围更大。基本上每5-10bp就可以找到一个好的
TALEN位点。ZFN目前是200bp-500bp. 另外TALEN的出现打破了ZFN在genome
engineering领域的垄断地位。将大大降低reagent的价格。现在法国的Cellectis就提
供$5000TALEN的订制服务。Sigma的ZFN价格也会跟着降下来。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 +1
我做过无数克隆了
从200bp的到12kb的insert
最近还做比较crazy的vector加4个insert片段一起ligate
从来都是vector:insert是insert过量
不管Insert长短 |
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D*a
发帖数: 6830 | 3 或者也可以设计三个引物，triplex PCR
这样的好处是带的大小可以比较一致，不会出现类似WT大带1000，KO小带200bp 的情况。 |
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m*****n
发帖数: 760 | 4 I used to order ~200bp, which cost me more than $100.
how did you get $99 for a 500bp oligo?
it would be great if you could share the experience. thanks |
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e***o
发帖数: 344 | 5 thanks a lot for your reply. it really makes sense. but i am getting even
more confused, as my pcr product should be just 200bp. i amplified dna from
plasmid.
i dont know exactly Bio analyzer works. could it be possible that this is
caused by single strand dna? |
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h******t
发帖数: 56 | 6 多谢答复,我们sort 以后是要继续culture的，这样看来这个系统就会比较nasty.如果
env除了frame shift,同时有200bp碱基缺失，是不是安全系数可以提高很多。唉，本来
打算今年要孩子的,现在看来要继续退迟了。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 7 我用过一个截短的ef1a，大概200bp长，表达量不高但是比较稳定 |
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K*C
发帖数: 2825 | 8 好像目前我用的最大也就125bp，再大了就是cDNA合成了。 |
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b******y
发帖数: 627 | 11 not sure but not far from gene synthesis. |
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K*C
发帖数: 2825 | 12 IDT：
25 nmole = 15-60 bases
100 nmole = 10-90 bases
250 nmole, 1 µmole = 5-100 bases
10 µmole = 5-50 bases |
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I***a
发帖数: 13467 | 15 多谢，
比较两组老鼠一些基因的表达差异，
我本想把引物放在离mRNA尾巴的200bp左右，但是不知道有些区域是不是转录后被剪切
掉了
以前做细菌的，对高等生物的这些实验细节不太清楚。 |
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S***6
发帖数: 431 | 16 Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是... 阅读全帖 |
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m****n
发帖数: 1066 | 17 1.PCR product is about 200bp. PCR product was run on an agarose gel, cut off
from the gel and purified using a Qia quick gel extraction kit from Qiagen
. The elution buffer doesn’t have EDTA.
2.PCR primers were used as sequencing primers.
3.During the first try, some part of the sequence was readable. The
remaining was mixed with NNNN.
4.During the second try, I redid the PCR and gel-purification. All of the
sequences were NNN. The same sequencing contractor was used.
I like to make some change... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 18 一般测序貌似前50bp信号都不好。你一共200bp，有1/4测不好。当然也要考虑一下前面
50bp是否是你的关键序列。 双向测序倒是可以解决。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 19 crispr这个东西，能用来做knockin插入1-200bp的片段到基因组吗？
zfn |
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o**4
发帖数: 35028 | 20 能做knockin插入1-200bp到基因组吗？ |
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m******e
发帖数: 459 | 21 如大家讨论的，非同位素探针背景强可能是一个原因，另一个原因可能是基因组DNA除
蛋白不彻底，有nuclease残留，另外也要注意酶切时间和酶的质量，有些酶长时间孵育
会产生星活性。
关于探针，同意lotkaeuler11的看法，先把探针序列克隆到质粒上测序确认是最保险的
办法。只要特异性够好，探针长度应该不是问题，我用过500bp-2k的探针，我还见过有
的paper用200bp探针的。探针杂出marker的条带并不奇怪，我用过的几个探针都是这样
。 |
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K*C
发帖数: 2825 | 22 做了个蛋白的mutant，换了200个bp左右，结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
倍。然后做了一下
qPCR，发现是RNA的问题，RNA量下降了64倍。
然后我把这个mutant的200bp分成了3段，每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type，把上面3段中其中一段突变
到mutant的序列，结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
成mutant的序列。
我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
东西会影响transcription。谢谢！
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
taacggcagcccactgtattaatcagaccaagagcgtttcagttattgtaggggaaatagacatatcaagaaaaga
aaccagacgtcttctttctgtggataaaatatat... 阅读全帖 |
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X***n
发帖数: 366 | 23 一般来说2-7位最重要，不能有任何错配，3‘端最不重要。但具体每个microRNA不同的
，有的3'端很重要，不能有突变。
加上stem-loop上下游各200bp最好。 |
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z*t
发帖数: 863 | 24 can we run page with short PCR product(around 100-200bp)? |
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z*****3
发帖数: 65 | 25 Qiagen Kit 回收100bP PcR产物，纯化后跑胶验证，发现200bp，300bp处，以及更大的
地方出现杂带，到底怎么回事？ |
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f******g
发帖数: 1003 | 26 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
谢谢 |
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n********e
发帖数: 72 | 27 我的经验是QIAGEN融解胶的时候室温+vortex,EB不预热显著提高回收率（2%胶回收~
200bp带）。 |
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n********e
发帖数: 72 | 28 我的经验是QIAGEN融解胶的时候室温+vortex,EB不预热显著提高回收率（2%胶回收~
200bp带）。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 产物不能太长，
应该在50-200bp 之间
最后手工检验一下产物最好不经过一些比较奇怪的地段（比方说超高GC%之类）
the
let |
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b**********8
发帖数: 349 | 30 又来请教各位大侠了，
我最近发现对一株细胞做某种处理后，一个基因（暂命名为A）的mRNA和protein都显著
下调，结果已经重复多次。现在推测这种处理因素可能会影响细胞株中A基因的转录，
于是构建了一系列逐渐缩短的启动子报告基因（基于pGL3-basic载体）和renilla载体
一起转染细胞。双荧光素酶报告基因分析发现从转录起始位点上游1000bp处开始，一直
到上游150bp，跟对照处理相比，处理组细胞的报告基因的活性一直都有显著下降。见
图A所示。但是当把所有组的报告基因活性都先被对照组pGL3-promoter的活性
normalise后，统计分析却显示到上游200bp时报告基因的活性就没有差异了。两张
figure都是在grapad prism里面用two way anova做的统计分析，结果却截然不同，这
关系到我接下来具体分析哪一个区域的问题，请大家帮我看看，到底哪一种统计方法更
合理？谢谢 |
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z*t
发帖数: 863 | 31 circRNA平均有多大？
RT－qPCR的amplicon一般要在100-200bp之间，要知道back splicing的site才能设计RT
引物吧？ |
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a*****l
发帖数: 244 | 32 想用CRISPR在iPSC里搞point mutation，看了一下最简单粗暴的方法是合成Donor DNA
（100bp-200bp），合成gRNA ，然后买现成的Cas9蛋白直接搞。
听说 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成DNA 不错，但不知道哪里去合成gRNA
和买Cas9蛋白比较靠谱。具体来说，请教大家以下几个问题，希望大家多多指教！
1）gRNA去哪里合成？听说合成的RNA错误率比较高，还是让公司做 in vitro
transcription 更靠谱？
2） Donor DNA用双链还是单链比较好？
3） Cas9 蛋白在哪里买好？
最好是美国公司。谢谢大家！ |
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l********e
发帖数: 415 | 33 Rneasy Kits worked fine for us.
You do need to remove DNA as they can be incorporated into the sequencing
library.
However, DO NOT perform the standard on-column DNase treatment as it lead to
dramatic sample loss and often times not complete. I would just Dnase the
sample after purification and heat inactivate.
Please note that the regular Rneasy columns do not work well with RNA <
200bp. Therefore, if you want to look at small RNA, you might need a special
kit. |
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n**u
发帖数: 87 | 34 chose custom, and the last column is where you can choose different protocol
. change primer to different location, like 200bp up or downstream.
：谢谢楼上各位的建议！
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n**u
发帖数: 87 | 35 chose custom, and the last column is where you can choose different protocol
. change primer to different location, like 200bp up or downstream.
：谢谢楼上各位的建议！
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e*********6
发帖数: 3453 | 36 在bioinformatics里边，各种做prediction是个热门话题，但是有个问题始终搞不明白
比如看这篇文章，http://www.nature.com/articles/srep28517
他的方法以及他对比的方法，都有1%的false positive，这在同类研究中已经算是非常
好的成果了, 画个ROC算个AUC都很好看，但
是有个问题很不解，因为在整个基因组上，想要的interesting points（这里是
promoter）是非常非常稀疏的，也就几万个，人体基因组有3 billion bp，就算100个
bp一个间隔来创造备选的样品（长度200bp来算只有50% overlap了），这就有30
million个samples，就算百分之一的false positive，那就有30万个false positive，
已经是true positive的好多倍了，这种问题如何在进一步解决呢？
并且，类似这种paper，包括发在非常decent，high-impact的journal上的（包括plos
系列，BMC系列，包括这篇是nature系列的），都没提到过如何解决这... 阅读全帖 |
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r**********e
发帖数: 587 | 37 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
如果是的话，我能想到的可能性时有：
1.region1除了pre－mRNA之外还存在着其他的RNA比如lncRNA
2.region1在被splice形成RNA lariat之... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 38 镰刀性贫血症，通过干细胞好像在作了？还有那个艾滋病，白人里有1%的人是天然带一
种突变，病毒不能感染，这个点突变应该可以通过干细胞改造来完成。
上面各位，CRISPR的off-target不是新鲜事，不然就不会有人作那个Cas9n了。这个是
切一条DNA链的，一个切点不会出现DBS,就没有indel了。只有设计的两个guide-seq比
较接近（200bp以内？）时，才有可能出现DBS,才有修补和突变的机会。这个应该大量
减少off-target的突变。 |
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l*******l
发帖数: 248 | 40 -We have two bonds A and B. Suppose we have 50m notional outstanding
on both bond A and B. We can buy CDS to protect our positions. The CDS
on A has a spread of 100bps, with a recover ratio 60%. The CDS on B
has a spread of 200bps, with a recover ratio 60%. A third party offers
CDS on the A and B, what can you tell about the spread of this CDS? |
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g***e
发帖数: 577 | 41 on A and B means recover on default event of either one ?
100bps /60% = Default prob of A = 1/60
200bps /60% = default prob of B = 1/30
so survival of A and B = 59/60 * 29 /30, assuming no correlation. |
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