y*****o
发帖数: 1011 | 1 刚做了BrdU，用20ug/ml prok消化10min，效果很好。
现在要开始做TUNEL了（同一咱tissue），用的是Roche的in situ cell death detection kit，里面提到15ug/ml proK在25-37度下5-30分钟。
想知道如果知道了brdu中，用20ug/ml prok消化10min可以的话，在TUNEL中也用这个条
件行吗（20ug/ml会不会太harsh）？还是试比如15ug/ml proK 37度下 15-20min？
我觉得20ug/ml prok消化10min 应该可以，不过实验室的人不是很同意，说还是用15ug
/ml.。
新手，请指点一下吧，谢谢！ |
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s****l
发帖数: 395 | 2 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
ug |
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W*********n
发帖数: 775 | 3 几个问题：
1）" Most ppl use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling" ,这样做就不
会引起carbamylation之类的问题了吧？对质谱分析结果不会有影响了？
2）LCMSMS分析到底需要多少上样最好？ 听做质谱的老师讲不要超过25ug, 20ug左右应
该最好，几个ug就可以获取一些数据。请问1ug和20ug上样量作出的结果到底相差多大？
3）我的实验就想看看把一个信号传导比较上游的蛋白酶给抑制掉之后，看看下游的蛋
白及受其影响的蛋白的变化情况，在蛋白水平上看看一些效益蛋白的变化，在磷酸化水
平上看看受这个蛋白酶磷酸化调控的蛋白（这个蛋白磷酸化调控很多下游蛋白）的情况
。这样的蛋白应该是pY or pS/pT都有的吧？
4）我的样品是低等动物的单层细胞的肠，而且样品很少，你觉得什么方法处理最好，
是否8M Urea 最好？还有，这个质朴实验室用一种IEF buffer(7M Urea, 2M thiourea,
4%CHAPS), 是否这个也行？
谢谢！
ppl |
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b****u
发帖数: 2771 | 4 1）" Most ppl use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling" ,这样做就不
会引起carbamylation之类的问题了吧？对质谱分析结果不会有影响了？
Use tris buffer to scavenge cyante ions if heating is necessary.
2）LCMSMS分析到底需要多少上样最好？ 听做质谱的老师讲不要超过25ug, 20ug左右应
该最好，几个ug就可以获取一些数据。请问1ug和20ug上样量作出的结果到底相差多大？
even 20 ug is overkilled for most proteomic labs with nano or cap lc setup.
for phosphoproteomics, you need more starting materials and enrichment will
take care of the loading capacity.
3）我的实验就想看看把一个信号传导比较上游的蛋白酶给抑制掉之后，看看下游的蛋
白及受其影响的... 阅读全帖 |
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o***s
发帖数: 42149 | 5 南京市民陈女士现在再也不敢带儿子翔翔到路边看汽车玩了，因为前不久，翔翔查出了血铅超标，医生怀疑和过多吸入汽车尾气有关。南京早已使用无铅汽油，为何翔翔还会血铅超标呢？昨天，扬子晚报记者从南京市妇幼保健院获悉，据监测，目前南京学龄前儿童血铅水平总体呈下降趋势，但医生提醒，地面以上1.2米区域是铅气、铅尘聚积区，儿童尤其应当注意。
名词解释
铅
铅是一种对神经系统有损害的重金属元素，主要经呼吸道、消化道和皮肤吸收，进入体内后随血液分散到全身各器官组织。过量摄入铅会引起儿童注意力不集中，多动和学习障碍，严重的还可出现贫血、腹痛、头痛、惊厥和昏迷等症状。由于儿童铅中毒是一个体内缓慢沉积过程，轻度中毒临床症状不明显，家长不易察觉。
A 每天早高峰看汽车，2岁幼儿血铅超标了
“去市妇幼体检说儿子含铅量115，特重，过三个月复查，如果还是这样就要吃药了。我家儿子就喜欢看汽车，看来要换地方玩了。妈妈们要注意些什么才好呢？”近日，西祠网友“大眼睛美妹”发的一条求教帖引来不少人关注。
昨天，扬子晚报记者与发帖人陈女士取得联系。陈女士家住南京和会街靠近中山北路一段，两岁的儿子小名叫翔翔。翔翔特别喜欢看汽车，陈... 阅读全帖 |
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c******n
发帖数: 16666 | 6 看标题就知道是转自知乎了吧
。。直接拉到最后有亮点 30流明
全麻是一种怎样的体验？
麻骑士，拥有骑士精神的麻醉医生
收起
陈大木头、大饼脸君、盛璟 等人赞同
我是麻醉医生，我亲测答题！
我没得什么病，或者得了精神病，我今年年初（一月份）写年终总结，统计去年我的手
术量，做了九百多台手术的麻醉，而我却未曾体验过整个全麻过程是怎样的感觉……顿
时，一颗好奇的心骚动起来，我提出由我的同事为我做一次全麻，并按照我的用药习惯
制定详细的步骤。
本人男 29岁 身高175cm 体重70kg 烟史5年（请不要在意这些细节，勿喷），无酒史（
偶尔啤酒），无手术史、过敏史，无高血压糖尿病等其他基础疾病。
下面我详细写出每个步骤，及切身体会：
1、术前药：右美托咪定30ug，昂丹司琼4mg，地塞米松5mg（置于500ml生理盐水静脉滴
注）~没啥感觉。
2、全麻诱导药：
①依托咪酯10mg缓慢静推~有点困了，但我努力地保持清醒，并试图通过说话证明自己
还清醒。
②顺式阿曲库铵10mg快速静推~眼皮抬不起来了，卧槽，我要被放翻了！
③舒芬太尼20ug快速静推~有一丝天旋地转的感觉，后面不知道了…
3、气管... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 7 for genomice southern, you should have very good quality DNA
and digest it completely. it is better to purify the gDNA
and remove anything that may inhibit digestion. typically,
i would digest about 10-20ug of gDNA O/N with enough enzyme
and add another shot next day. it is not suggested to add
EtBr into the gel, though i found it was fine with mine.
you should follow a good protocol that is known to work for
genomic southern. my opinion is that transfer should be very
good. after depurination a |
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m****m
发帖数: 395 | 8 我用了 100 ug/mL 。。。
20ug/mL就够了吗？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 9 50ng/ul够了啊，多加几微升不就行了。:) 我送过20ug/ul的样品也测出来过的。关键
还是要够纯。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 10 用过一个，不work，western 出来跟木炭画一样
horrible customer service
竟然说因为他们内部的测试不包含我要用的application,不能refund或者exchange
ＸＸＸ，网站上面明明写着western blot的species包括ｍｏｕｓｅ/ｒａｔ
还让我试着尝试load 100-200ug 的蛋白，然后用１：５０的稀释抗体
这种浓度要求，估计我要拿个发酵罐专门express这种蛋白，然后一管抗体只能用一次.
.......
换了一家公司，20ug load 量 1：1000稀释 ，条带清清楚楚， |
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W*********n
发帖数: 775 | 11 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？
谢谢! |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。
最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品... 阅读全帖 |
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W*********n
发帖数: 775 | 13 你才有才了，King of MS! 我这一阵子可能经常向你请教一下
my priority is change in protein at this experiment. The MS lab manager said
20ug protein can be loaded.
The I will try to use 8M Urea to do the lysis,and then altrosonic and boil
and then run the gel.
What should I do if my priority is phsophorylation change?
Thanks! |
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a*******a
发帖数: 4233 | 14 不需要洗， 收病毒上清以后pall 0.45um滤器过滤一下。
我一般用fugene hd， 更省事
10cm dish 20ug质粒，50ul fugene。
我是用plko+r8.91+vsvg的。
ps 我个人觉得钙转最省事
5min转完， 10-24小时之内看心情换液就可以了。。。。
脂质体的话还要等半个小时穿插传其他细胞，麻烦。。
，不洗的 |
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s***i
发帖数: 160 | 15 周一到今天连续每天跑两个胶
结果每个都有问题
取成年小黑鼠样本
测PDK1，P-PDK1 还有其他protein
第一次的样本是上星期做的，结果pdk1 和P—pdk1 各出来bands，PDK比 P-PDK弱，第
一个不解
怀疑操作有问题，另取样本重新制作，第二次PDK没显示出来，P-PDK却一直存在，只不
过对比第一次稍弱
因为只load10ug跑胶，怀疑太少重复第三次，20ug，其他条件和第一次一样
结果PDK1还是没有显示 P—PDK1有显示
怀疑抗体浓度不够，今天使用一抗和二抗都用1：500，之前一直用1：1000
换用TPS—T 冲洗，之前都用PBS—T
另外操作过程反复检查过，把蛋白转到膜后ponceau检查没有问题，5%nonfat milk
incubate 1.30小时，冲洗都足15min，一抗体4度冰箱过夜，冲洗三次后二抗两小时，
再冲洗三次。抗体用的是cell signaling technology的。
百思不得其解，为啥第一次显示得出来~
另外同在一个胶跑的还有AKT和P-AKT，AKT显示正常，就是P-AKT有超多nonspecific
bands，有什... 阅读全帖 |
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m*******e
发帖数: 90 | 16 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高. |
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D***a
发帖数: 516 | 17 ascites fluid便宜，但不是很纯，可能生产出的抗体85%是你要的，另外15%是小鼠自
己的。
如果用体外无血清培养，假如能得到20ug／ml的抗体，那你需要10，000ml的培养基，
成本不高，只是工作量大。找公司或学校core facility做吧。 |
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