u***e
发帖数: 71 | 1 请问高人，有没有什么办法在一个22kb的plasmid中特定位置插入30 bp的序列？谢谢 |
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H*g
发帖数: 2333 | 3 The longest I've done is around 15kB and to insert 2 kB, very very tricky
and picked a lot to get the correct one~
Not sure about 22KB, I guess it is worth trying. |
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X***n
发帖数: 366 | 5 Single strand DNA plus small amount of plasmid, do red recombineering.
Google.
请问高人，有没有什么办法在一个22kb的plasmid中特定位置插入30 bp的序列？谢谢
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n********k
发帖数: 2818 | 6 Recombination/gateway cloning would be the way to go, very easy if you know
the system, check liu pengtao's work...
For traditional cloning, Sunny's suggestion is the way to go... very easy
too if one is experienced with the MB and the 22kb plasmid itself is not
weird...try to have the insert size about 100-500bp...size in this range are
easier to handle than longer or shorter ones in general... |
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d******a
发帖数: 32122 | 7 剃刀和茄子的故事(十一. 一路上有你) (2KB) 4 推 剃刀和茄子的故
事（十.都别吵了，新作！有SM情节！！！赶快进来看！！！） 剃刀和女同事的
故事 九
我和茄子的故事（八）——毛泽东思想 (2KB) 23/229 OckhamT1
2013/04/16 OckhamT1
留 剃刀和茄子的故事（整理版) (22KB)
推 剃刀和女同事的故事 七 （下）
推 我和女同事的故事（七）
推 剃刀和女同事的故事 ---
:01
推 茄子接着写剃刀的我和女同事的故事的女版 -(353B) 24/159 |
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p********n
发帖数: 273 | 8 已删除邮件
所有已删除的邮件将暂时被移动到已删除邮件文件夹，它们会随时被系统清空。
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Chase Credit Cards
Donate to Japan relief through Ultimate Rewards
上午 5:15 22KB
未读
Delta Air Lines
Donate Miles Or Money To Help Those In Japan
11年3月17日 周四 19KB |
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x**e
发帖数: 315 | 9 ■ 単行本未収録作品（英語版）
http://www5.kiwi-us.com/~nakasan/
J.D.Salinger
単行本未収録作品
“The Young Folks（若者たち）” 32KB
“Go See Eddie（エディーに会いな）” 28KB
“The Hang of It（じき要領をおぼえます）” 21KB
“The Heart of a Broken Story（できそこないのラヴ?ロマンス）” 39KB
“The Long Debut of Lois Taggett（ルイス?タゲットのデビュー）” 45KB
“Personal Notes on an Infantryman（ある歩兵に関する個人的なおぼえがき）” 22KB
“The Varioni Brothers（ヴァリオーニ兄弟）” 51KB
“Both Parties Concerned（二人で愛し合うならば）” 43KB
“Soft-Boiled Sergeant（やさしい軍曹）” 42KB
“Last Day of the Last Furlough（最後の休暇の最後の日）” 62KB
“Once a |
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b****r
发帖数: 17995 | 10 构建了个CONSTRUCT，从基因组扩了16KB,插入表达载体，总长大概是22KB，但是做转染
没结果，想不明白。这个也就算了。测序都测不出来，作为困难模板，BAC测都不行。
而我从这个CONSTRCUT里面扩增小片段测序可以的，真遇到鬼了。是不是测序公司太烂
了，还是怎么回事？ |
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a****d
发帖数: 1919 | 11 Two step PCR should work for your propose.
synthesize two pair of primers:
F1-xxxx
30bp-xxxx-R1
F2-xxx-30bp
xxxx-R2
PCR separately, then put together both products as template, PCR again using
F1-xxxx and xxx-R2. The final PCR product could be subcloned into the
plasmid. You have to find the suitable digestion sites when designing
primers though. |
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H*g
发帖数: 2333 | 12 I will use Quikchange Site-mutagenesis Kit to do this insertion. |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 太长，很难得到中间不出任何错的全长产物。
楼上建议的那个2-step PCR 是正确方案。关键就是要找两个unique restriction
sites用来做Primer F1 and Primer R2, 最后把PCR product 连进去。 |
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z*t
发帖数: 863 | 15 30bp能用的酶切位点不多吧？是不是可以试试平末端连接？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 不是这个意思。
要找的两个酶切位点都是离开要放进去的位置有一点距离的（比方说各离５００bp)
然后把整个长度(1kbp)的终产物给PCR出来，然后再利用那两个位点把全长一千的
产物放回去。 |
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f**u
发帖数: 346 | 18 这种情况用ssDNA做recombineering是最好的，然后PCR盲筛。
400到500个colony里面肯定有你要的。 |
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h***e
发帖数: 146 | 19 先用recombineering引入一个counter selection marker, 然后用合成的ssDNA每端大
约50bp的同源臂，再次recombineering消去反向选择的marker，也不用盲晒，酶切鉴定
然后测序。我现在就在做点突变用这个方法，大约20kb，效率在10-20%左右 |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 Recombination/gateway cloning 怎么用来做这个么？能不能解释一下？
know
are |
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z********r
发帖数: 179 | 22 use PCR
recombination would not work because such small fragment will be lost |
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n********k
发帖数: 2818 | 23 never did cloning this way myself...but I advised my former roommate to
develop the tech and I remembered he inserted three LoxP sites into a 25kb
or so plasmid within literally 2-3 weeks...I could be wrong since I was not
the one doing it...but I thought the concept was simple: u have the homology
adapters flanking the sequence of interests...someone say 30 bp may be too
small and could get lost...never did myself, don't know(maybe I shouldn't
have commented so surely:)))...I could ask my form... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 我倒。。。gateway system 不是做这种活的。
用楼上说的，先搞个单链，然后再recombination ，理论上倒是可行，
不过我从来没有那么做过，不知道难度有多大。
你室友具体是怎么做的？去问问他吧，我很好奇呢。
not
homology
too |
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a****k
发帖数: 1130 | 25 我是想推荐看看isothermal assembly reaction行不行的。。。
not
homology
too |
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h******y
发帖数: 55 | 26 在插入位点两侧找合适的酶切位点，然后合成有相同位点的带有30bp插入片段的序列，
直接置换就可以。能找到合适的酶切位点就可以。
大片段backebone连接可以用胶连接。我们做过30多k的。
有没有包子？还没有收过包子呢！ |
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a****d
发帖数: 1919 | 27 楼上的，大片段backbone用胶连接，能不能具体解释一下，和ligation有区别吗？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 30 Have u checked Liu pengtao's work? In principle, I don't see why it won.t
work...it is kind of like gateway cloning, but not really, I have to admit
that... |
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n********k
发帖数: 2818 | 31 Kind of like add peg, right? Or better? |
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u***e
发帖数: 71 | 34 Thanks. How to link the first two PCR fragments together?
using |
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n********k
发帖数: 2818 | 35 sure, it is a nice way...nonetheless, sunny's restriction way would be
direct enough...the others could all be nice training/experience but maybe
not neccessary at all... |
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x*****e
发帖数: 309 | 36 看来做cloning 的人还真不少，其实我建议不要纠结于连接了。设计PCR得到5+5=10kb
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。 |
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