b**********8
发帖数: 349 | 1 多谢回复，其实之前我们用的protocol就是根据tronolab的来的，在我的这个帖子里有
我们之前的方法介绍，http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31599323.html
根据我最近几次摸索的经验，用磷酸钙转染有个缺陷就是换液之后必须用PBS洗两遍，不洗的
话后面收集的virus里有很多磷酸钙沉淀，感染细胞后medium里面很多黑色的小点点，
这玩意对感染效率影响蛮大的。但是PBS洗的话，293FT细胞很容易就飘起来了。我现在
就想省事点，换个转染试剂转染，换液后直接加新的medium。请问你有用lipo做过吗？
我现在就是没有经验用lipo的话，DNA量该用多少。以10cm dish为例，之前我们四个质
粒加起来一共有40ug，如果用lipo等转染试剂的话，我想应该用不到这么多DNA吧。 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 2 准备用293FT做lentiviral production，12well刚换了media发现大部分cell都被冲掉
了。。。有啥建议啊？谢谢 |
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v***2
发帖数: 131 | 3 293FT 贴必不牢，不要等到100% confluence再分，保持在70-80%confluence即可，如
果仍有麻烦，处理如同悬浮细胞 |
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s******s
发帖数: 13035 | 4 介个介个。我也做过293FT, 没这么容易浮起来啊！
你是不是加了质粒以后时间太长了？隔多久换的medium |
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a*****n
发帖数: 2835 | 5 you can also use regular 293t if you feel hard to handle 293ft
I usually use 293t for profucing lentiviruses. I do not change medium before
transfection but change medium 24hours after transfection. |
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c*z
发帖数: 157 | 6 方法（2）会把所有死细胞都收进去，做transfection还可以，做assay就可能有问题
293, 293T, 他们全家都是这样的
293FT还算好的，上面两个更容易冲掉，而且细胞之间binding更紧，容易cluster
如果电动pipet有blow out功能，要切换到flow out，沿着wall慢慢加，不行就用1mL
pipet加
dilution
pellet
use |
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b**********8
发帖数: 349 | 7 如题，以我的实验为例，需要制备针对某个基因的shRNA lentivirus，这个基因对细胞
的生长和增值很重要，刚好293FT里也有这个基因的表达。我的问题是，293FT培养基中
的virus会不会干扰293FT中该基因的表达？ |
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R*****s
发帖数: 41236 | 8 ☆─────────────────────────────────────☆
Rodimus (变叔 - 永动机器) 于 (Mon Jan 13 15:15:00 2014, 美东) 提到:
参加活动的进来占个楼，然后更新同一个帖子就好了，免得满版都是log贴，
请不要单独再开楼了，欢迎大家参加活动！
大使的【此恨绵绵】活动规则的link:
http://www.mitbbs.com/article_t2/Running/31713537.html
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Rodimus (变叔 - 永动机器) 于 (Mon Jan 13 15:17:29 2014, 美东) 提到:
我不参加最后活动奖励了，不过还是尽力坚持每天跑吧，实在跑不动了就歇.
(鞋都是inov8 155, 3.5mi都是Spin Class之后的砖头训练，跑步机上用foot pod
测的数据, 和跑步机自己的距离，速度大体吻合，不同机器，有些差异)
log:
date days score Distance... 阅读全帖 |
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a****d
发帖数: 1919 | 9 大家lab里面都会定期检测mycoplasma infection吗？
我们lab的最新指示是：所有的cell line，都要test mycoplasma infection every
month；我常用的293FT，HEK293，3T3 cell,从来没关心过mycoplasma，一样用得很好
，现在对于是否应该每月都花精力test mycoplasma非常怀疑。。。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 11 293T/293FT可以很容易到90%以上，293不太容易，70-80%是正常的 |
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s*********t
发帖数: 600 | 12 用来做293FT和ES细胞的内源的MeCP2的western blot／
我用了abcam的，号称ChIP级，但是好难用啊／
还有，这个MeCP2的human和mouse的两个的isoform分子量计算的都在53kD左右，怎么WB
检测的都是75kD呢？差的
也太多了吧？为毛啊？
谢谢！！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 13 如题，lab里面之前一直用的磷酸钙沉淀法，个人觉得特别繁琐。我比较懒，想换用
lipo2000或者genejuice来转，我们一直用的是PLKO.1shRNA+PLP1+PLP2+PLP/VSVG系统
，在10cm dish里面操作。有谁使用这套系统制备慢病毒，并且刚好也用lipo2000或者
genejuice转染试剂的，甩一个你们的成熟的protocol给我吧，特别是各质粒的用量，
换液时间，收集上清的时间等参数，越详细越好啦。不想为了摸索条件再浪费1个礼拜
的时间了。
谢谢 |
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b**********8
发帖数: 349 | 16 非常感谢。这个链接给出的protocol很详细。但是我又有一个新的问题，在还掉含有转
染复合物的medium之后，新加入的medium中添加了抗生素，这个会对之后感染病毒的细
胞有影响吗？会不会产生很大的毒性？因为慢病毒本身的细胞毒性其实也挺明显的，如
果再加上抗生素的压力的话，感染的细胞岂不是要死光光？ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 17 google tronolab
用lipo也可以做，而且很方便，质粒不变转染方法换一下就行了
其他收病毒条件什么的影响都不大。 病毒大致是在24-72小时之间出来。
问题在于如果需要浓缩的话，一次转几十皿用lipo成本太高。
常规抗生素没影响的。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 我们在60mm dish里面做的
4ml medium + 1ml lipo的mix
里面大概20ul lipo, 2ug pMDL， 1ug VSVG, 1.5ug Rev, your DNA 3ug.
，不洗的 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 20 不需要洗， 收病毒上清以后pall 0.45um滤器过滤一下。
我一般用fugene hd， 更省事
10cm dish 20ug质粒，50ul fugene。
我是用plko+r8.91+vsvg的。
ps 我个人觉得钙转最省事
5min转完， 10-24小时之内看心情换液就可以了。。。。
脂质体的话还要等半个小时穿插传其他细胞，麻烦。。
，不洗的 |
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L****S
发帖数: 76 | 22 three possible ways to solve this problem:
(1) Coat the 12-well-plates with vitrogen before plating cells:1/45 dilution
in 1X PBS overnight; 420μl/well;
vitrogen is from Advanced BioMatrix, Inc (5005-B)
Aspirate the nitrogen/PBS before plating cells
This will increase the adhesion.
(2) Collect used medium together with cells when you change medium, then
centrifuge at 1000 rpm (about 500 g, I am not sure, but any speed can pellet
cells without breaking should be ok) for 5 minutes, vacuum the medi... 阅读全帖 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 23 谢谢~是在transfection之前换media，不是要harvest或者split，vacuum后cell都还好
好的，加了media放平plate后都浮起来了，还没来得及加plasmid呢。。。
实验室有人建议poly-D-lysine coating，正在试
dilution
pellet
use |
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d*****i
发帖数: 3905 | 27 是在加质粒前换media，用的是12well，不知是不是和well大小也有关。seeding后过了
两天换media |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 12 well我就不知道了。我一般直接用10cm的 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 29 上来update下：现在的办法是头一天seeding，poly-D-lysine coating，第二天不换
media直接transfect。现在觉得还不错，cell基本不会被冲掉，GFP control发现
transfection efficiency大概90%，看来coating对transfection没啥影响~
多谢各位帮助！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 31 更简单的办法是超滤浓缩，millipore的100K Ultra Centrifugal Filter，可以直接浓
缩100-200倍。
4质粒共转染293T/293FT细胞，隔天换液，3天后收上清，然后超滤浓缩，浓缩后的病毒
直接感染靶细胞，效果会比冻融之后的好几倍到一个数量级。 |
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