s***l
发帖数: 42 | 1 1.start from 3-4ml fresh overnight culture, pellet cell in 8000rpm in cold for
3min
2.resuspend in 200ul P1
3.lysis with with 400ul P2 <5min in RT
4.neutralize with 300ul P3 on ice for 5 min
5.spin down 10min at maxi spped in cold
6.supernatant to a new tube
7.add 0.75ml cold isopropanol
8.spin at maxi speed RT for 15min
9.discard supernatant, wash with 0.5ml ethanol, spin 5min maxi speed in cold
10. asirate supernatant and air dry DNA till pellet starts to turn translucent
Caution: DON'T OVER D |
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N***P
发帖数: 153 | 2 260mg眼球组织（玻璃体，虹膜，视网膜，睫状体--除了巩膜角膜，其他能取的，都去
了）
按照Abcam的western blot protocol,5mg加300ul,这也太多了吧。而且晶状体里面大部
分是水。 |
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f******k
发帖数: 856 | 3 5mg加300ul，那260mg要很多了，要我做的话，我可能会加500ul。只是我的意见啊，仅
供参考 |
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S****2
发帖数: 164 | 4 1) non radioactive的EMSA kit发现pierce有卖，但文章很少，不知道能用不？
2) Chromatin IP，每次的sonication结果都不太一样，有时候200-1000 bp，有时候
1000 bp-genome size的smear
1% SDS根据millipore的EZ-ChIP自己配的
misonix 3000 with cuphorn adaptor
program： 10s On, 5s off, 30 cycles, 300ul sample volume, tube placed in
chilled water (if on wet ice，sds recipitates everytime within 1 minute)
谢先！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 我刚又测过一次，算了%cv，表现比较好的，是OD 0.8左右的核酸样品，%cv在1%左右，
表现差点的，是OD 0.3左右的蛋白样品，%cv大部分在5%左右，但是有一个样品的%cv超
过了10%。10%的误差对我的实验来说影响太大了。
所有的样品都是用的相同的buffer，测之前也vortex过。用的样品体积都是4uL。
相同的样品我在一台Varian Cary 100 UV-Vis spec上测过，样品体积300uL，光径1cm
，测量结果相当稳定，每个样品的%cv都低于0.5%甚至为零。
更郁闷的是，同一个样品在Varian和Nanodrop上测得的OD不一样，Nanodrop的读数比
Varian的普遍高25%以上。
我的Nanodrop肯定是需要calibration了，刚订了那个CF-1，先校准一下再看。。。不
知道calibration对reproducibility有没有帮助。
rumor |
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M*****n
发帖数: 16729 | 6 I did in 300ul two weeks ago with about 300ug DNA. it was OK. |
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d***y
发帖数: 299 | 7
RT, 1.3X107cell+10ug DNA in 300ul Serum free medium, RT 10 min.
电击完了以后是在室温放10min吗？
Put cells in medium (10ml) immediately after electroporation.
BTW: use 4mm gap cuvettes for electroporation |
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m*******8
发帖数: 256 | 8 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
感激！ |
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m***o
发帖数: 272 | 9 We want to inject around 5ul into neonatal mice. We have tried insulin
syringe 300ul volume. It works on a little older mice. Does anyone know
syringes even smaller? Thank you! |
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d****i
发帖数: 2346 | 10 细胞培养使用，能加100uL， 200uL, 300uL....up to 1000uL。如果能加150， 250这
种最好。超过1mL的我就可以用一般tip了。
谢谢！ |
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r******g
发帖数: 600 | 11 我做lipo transfect MCF-7
6 well plate- 2ml culture/well
一下protocol剂量 用于 one sample (1 well)
12.5 lipo diluted in 150uL OPTI-MEM
2.5ug plasmid DNA diluted in 150uL OPTI-MEM
sit in RT for 20'
把上面的两个150uL Mix 约等于300uL
sit for 5'
250uL used for each well for transfection. |
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