f*******8
发帖数: 3612 | 1
我想应该有更好的做法。
我比较欣赏我们公司的老板，其实公司很多人欣赏他。
属于很明白的人，即不显苛刻，也不至于油滑。
总在观察他到底怎么做的。差别在哪。
好象是一种肚量，肚量来自宽容和人情。
其实油滑还是改头换面的自我中心。 |
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h**2
发帖数: 2841 | 2 我的是E8200 wolfdale 6M
在原装速度，Idle温度：CPU@37C CORE@55C
stress test:CPU 43C CORE 60C
是不是太高？
如以前双核E6600 |
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c*******h
发帖数: 4883 | 3 37c core 27c CPU
不过我没跑啥大程序。 |
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h**2
发帖数: 2841 | 4 别人的E8200是27c cpu, 37c core
我的不光CPU偏高，cpu temp sensor和core temp sensor的差别也偏大
其实倒也不是在乎这些数字，只是不放心长期偏高对cpu寿命有影响——能挺个4，5年
就足够了 |
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s*****a
发帖数: 1269 | 5
My i7 930 liquid cooling, idles at 37C. |
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a***e
发帖数: 27968 | 6 又下了一个HMonitor
这个家伙报出来主板上8个电压，能认出来3个应该是内存条，1.65通通
一个12V,报12.5V,正常。 3.3V比较古怪，报2.25V,靠
VCore一点不动，1.52
有一个电压在0.92到1.28上下动，和CPU功率一起上下，看起来更像Vcore
还有一个1.85不知道什么东西
cpu功率满载147W,温度目前都是37C,还好
显卡凶猛，idle电流2.3A,跑个3DMark11居然上到52A
3DMark11 basic P4321分，不少场景只有10fps,够狠
应该用什么东西烤机？ |
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a*****s
发帖数: 2663 | 7 看来俺的这块CPU不行啊。还有一个奇怪的是idle还不如stock cooler（37C），
ambient大概28~29C。 |
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a***e
发帖数: 27968 | 8 X1C: 2GHz i73667, full load at 2800MHZ cpu stress, 54C and idle 39C and load
noise 33.2/34.4dB & idle 30dB
930: 1.7GHz i53317, full load at 1800MHZ cpu stress, max 48C, idle 37C noise
load 38/44dB idle 30dB
大家可以判断 |
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m********5
发帖数: 17667 | 9 i5都这样？
idle的时候才28-37C
只要所有core跑满超过10分钟必上95C
。。。
是不是导热脂涂太厚了？！
搞个212evo会不会有改善？！ |
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M****e
发帖数: 70 | 10 dude, you scared me:P. to tell you the truth, nothing but
truth, i think so ... well, don't tell boss and buy another
vial then. next time, try not to do that. i suggest you use
a cell storage from Nalgene. add isopropanol into it, put in
the vial with cells (cells are in DMSO and FBS), and put it
@ -80C. it is said to decrease the temp by 1C/hr. after
put it in the -80C two days, you can now transfer it to
liquid N2. when you thaw the tube from N2, put it in 37C
water directly, don't stand outs |
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r****o
发帖数: 105 | 11 I guess it is due to the residue of ethanol. Use a speed-vac to
dry down the protein pellet completely or incubate the tube with
the sample at 37C for hours. |
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d****h
发帖数: 46 | 12 上周从ATCC寄来的U87MG,
Eagle's MEM+1.2g/L sodium Pyruvate+10% FBS, 37C 5%CO2 培养
细胞呈长梭状，长得很慢，而且长到20%confluent 就基本停止生长了（如图）,传代后
也只能长到20%左右。
请问
培养基， 培养条件是不是不理想？我也试了DMEM
U87MG本身就是这样， 或者还有其他我没注意的问题。
我养其他细胞M059j,BHK，Huh7都没问题。
谢谢指教 |
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z*****n
发帖数: 236 | 13 Thank you very much. I am in the lab, can't input Chinese. I accidentally
forgot to take the dye solution bottle (not the solubilization/stop solution
) from the 37C water bath and it stayed there for 40 hours. Tomorrow, I will
run the experiment. I don't think I have time to test it before that. I
worried so much about my JIPIN boss coz she will definitely get mad at me.
Yes, it is an organic chemical solution ( the active component is called
tetrazole), not protein thing. Hopefully, it is fine |
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m****m
发帖数: 395 | 14 用饱和硫酸铵沉淀了蛋白，完全去除上清液后，PELLET用BUFFER溶解，先用PIPET轻轻
把PELLET打碎成小碎片，然后在37C超声水槽里超声，最后还是有微小的蛋白碎片怎么
都不溶解，测了OD280=2左右，也不算很浓啊，这个浓度的时候这个蛋白一般都是溶解
的，测了PH也没有问题。请问该如何让蛋白完全溶解阿？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 16 你用 4% PFA fix 20 分钟是不是顺便破细胞了？如果是的话你可以考虑用 BD
Biosciences 的 CytoFix/CytoPerm。我同时染两组细胞，一组用 1% PFA fix 15 分钟
染细胞表面蛋白，另一组用 CytoFix/CytoPerm fix 15 分钟染全细胞，CytoFix 处理
的细胞贴壁非常好，PFA fix 的细胞还是很容易掉。我用的是 glass bottom dish，
poly-L-ornithine 37C 处理过夜，第二天用水洗三次。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 17 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。 |
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g*******0
发帖数: 2152 | 18 Depend on what you want to do next. If you do stimulation and measure
cytokine production or do biochemistry (western or IP),seed the cells to
experimental plate, 37C 1-2 hour, before stimulation change media and wash
away floating cells by PBS. |
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b********c
发帖数: 161 | 19 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
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H*g
发帖数: 2333 | 20 Thank you, guys!
I sequenced my expression plasmid and I am sure it is correct, no frame
shift, no mutations. I feel my protein
is not toxic to E.coli. I shaked the E.coli culture at 37C till OD600=0.6,
then add IPTG to 1mM. I also had a
second culture but not add IPTG.
I took 1.5mL every hour for 7 hours from both cultures (with and without IPTG), spin
down, sonicated, and loaded side-
by-side on SDS-PAGE, I couldn't see any band being induced.
I would try lower temperature and lower concentrat... 阅读全帖 |
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w*********e
发帖数: 98 | 21 I inoculated 5ml overnight culture (37 C)into 30ml medium because I was
using 18 C to shake ( cell grows much slower than 37C) until OD is 0.8 and
then I added IPTG at final 0.1mM. The speed of shaker when I started using
18 C is 350 rpm.
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w**t
发帖数: 52 | 22 We use the following protocol to prepare total DNA:
Zymolase/Sorbital/Tris/EDTA 1h @ 37C
SDS/EDTA/Tris 5min @ 65C
KAc 1h @ 4C
Top speed spin
isoprppanol/NH4Ac precipitate
70% EtOH wash
Dissolve in TE with RNase
The DNA prepared in this way could be transformed to E. coli to recover
plasmid or subjected for PCR for cloning. |
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h******y
发帖数: 351 | 23 这家公司也在卖水稻表达的人血浆白蛋白。
http://www.amsbio.com/Animal-free-Human-Serum-Albumin-HSA-ecoHS
上几张他们网页上的图给大家看看，行家说说这样的活性算不算好。
Purity and Size of Competitive HSA Products by SDS-PAGE
Figure 1 below shows a Coomassie blue stained gel (left) and a silver
nitrate stained gel (right) comparing size and content of competitive HSA
products. The figure shows that there is no difference in migration patterns
or purity between: 1) ecoHSA™ , 2) a commercial human plasma serum
albumin purchased as a lyophilized ... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 24 Short answer is NO.
MeOH can dissolve nitrocellulose in 10min at 37C.
I never did the soaking before transfer. But tried once after transfer with
MeOH and did not destroy the membrane at least. To be safe, don't soak
nitrocellulose in MeOH.
EtOH is not strong as MeOH. Some type of nitrocellulose is safe in EtOH. |
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h***a
发帖数: 145 | 25 可以用trypsin吗？我们用了0.25%trypsin处理6个月的小鼠的hypothalamus 20mins at
37C,怎么感觉完全没消化啊。
用pasteur pipets 吹打的时候完全吸不进去。。崩溃。
高手指点一下吧。多谢啦！ |
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T**********r
发帖数: 287 | 26 之前用24 well plates+martrigel:
1.100ul cell suspension + 100ul matrigel,放在24 well plate里，on ice 10 min.
2.37C for 30 min.
3.Add 4% PFA, fix for 30 min.
4.Immunostaining.
这个protocol有两个缺点：
a. 过程中细胞损失太多，2000 cells 最后剩下不到200.
b. 在martrigel厚的地方的cell没办法被抗体lable.
希望大家指点一下。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 27 谢谢楼上几位！
1. 我要做peritoneal macrophage和splenocytes的bancteria killing。
2. 我是从mouse分离细胞后，把splenocyte (2x10^6)和bacteria混合在1.5mL的tube里
面，然后
放在37C培养箱30min。然后1500rpm离心，结果发现要么没有沉淀，要么在下一步洗去
bacteria的时候细胞沉淀就没有了。很郁闷！本来应该是这一步离心之后细胞形成
pellet，细菌在上清，去除上清就可以去除细菌了。
3. 做过的同学你们是怎么做的？
4. 后面还要用macrophage做同样的实验，这一步不能继续了，不知道怎么改进。
非常感谢！如果哪位手里有详细的protocol恳请能分享一下。 |
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c*****i
发帖数: 1392 | 28 不应该啊，无论是否有phagocytosis,至少细胞应该在。37C后，是否在显微镜下观察细
胞形态完好？考虑换buffer看看 |
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l****j
发帖数: 70 | 29 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
will |
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l**********8
发帖数: 2 | 30 Hi, are there anyone familiar with E coli?
I've screened some mutants and is trying to confirm them by doing site
mutagenesis and spot titration. But, during the process I found my
transformants which were streaked out twice, were contaminated by phage (
precipitates and clear o/n culture without many cells). When I am doing the
o/n culture, I found that if I add Kan, there would be a phage problem, but
if I didn't, there wouldn't. This makes me sooooooo confused and
disappointed. I wonder whet... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 31 室温混合一下就可以上样跑胶了。有些人37C保温一下。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 32 连Pipette都不会用的小本反而好带，一张白纸，示范几次就能学的很像样了。这种半
桶水晃荡的最难。水浴锅的使用演示过了，也说过这种小体积，短时间的的反应最好用
水浴锅，控温效果比PCR机和Heating Block好，但是到实际操作就自说自话的变成25C=
室温，37C=大肠杆菌的培养箱。我估计她是觉得水浴锅加热太慢，懒得等而已。
还有很多小事说过了第二天肯定记不住，再讲再忘。比如样品我让她放在冻存盒里再放
-20C冰箱，但是经常是做完实验往4C冰箱某个角落里一塞就走了，第二天再到处找。菌
种不好好保管，平板不倒置结果弄得到处都是水，性格再好的人也要怒
酶全扔掉是只因为保存不当，而是她没有告诉任何人就悄悄地一个人开始做ligation，
很担心这几个酶是不是也被污染了。 |
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z*t
发帖数: 863 | 34 我之前也有过同样的问题。。。不过我使用invitrogen pDonor vector作为donor
我后来用了1uL的recominase,四度过夜后室温3小时，PK 37C 30min(好麻烦-_-||)
后面colony的postive rate能达到90%左右
还有mannual上说supercoiled plasimid间的recombination效率最高，试一试用非AMP
抗性的supercoiled vector吧
didn |
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A******y
发帖数: 2041 | 35 Actuallly in my experience, it is very good at getting rid of DNA without
the DNase step. However, I still do it though. The old kit instruction (7+
year) actually tell you to do the DNase step for 30 minutes in 37C. The
new Qiagen kit told you not to do it. |
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I*******U
发帖数: 869 | 36 最近要提取从白色脂肪里面提取SVF，根据protocol我确实看到了pellet，用TRI-
reagent也提取到了mRNA,nanodrop测出的浓度有800ng/ul，但是我试了cyclophilin，
gapdh，18s几个内参，都测不到CT值。已经重复几次了，郁闷的不行。请教各位，有什
么建议么？
SVF protocol
1）isolate WAT,
2) Incubate tissue @ 37C for 45min with shaking @ 80 rpm （Collagenase I，
1mg/ml）
3）300g for 10min
4) Dissolve pellet in Tri-reagent. |
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c*****i
发帖数: 1392 | 37 Hybridoma是最容易复苏的一类细胞了。 37C水浴速融，贴壁的Hybridoma直接加入培养
瓶，2小时后换液，可用20％FBS。悬浮细胞解冻后加1ml培养基，慢速离心1000rpm，
5min，去上清，加新鲜medium，培养。若细胞太少，培养一周后看
10000rpm
了。 |
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m****a
发帖数: 270 | 38 对于第三点你没仔细看论文吧？
看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但
是24h load的gDNA明显减少。
作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可
能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在
37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。 |
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H****N
发帖数: 997 | 39 Dear colleagues,
the publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078 triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gene editing purposes in human cells. Ago had been described as an DNA-guided endonucleases two years before, through a Dutch-Spanish microbiologist collaborating team (Swarts ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 40 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: hanchunyu (), 信区: Military
标 题: 韩春雨是第二个小保方－业界专家的信
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 29 11:59:57 2016, 美东)
Email on ngAgo sent to the ISTT mailing list：
Dear colleagues,
the publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078 triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gen... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 41 国际转基因技术协会原主席Montoliu博士建议不要再试图重复韩春雨实验结果
澳大利亚国立大学Gaetan Burgion今天撰写长文介绍他试图重复河北科大韩
春雨创立的NgAgo基因编辑技术的经过，得出结论：韩春雨的实验无法重复，而
且与韩在论文所说矛盾；《自然·生物技术》应要求韩公布原始数据；该技术显
然没有前途。
国际转基因技术协会创建者和原主席Lluis Montoliu博士根据这一结果以
及其本人实验室的实验结果，向国际转基因技术协会会员发出一封公开信，建议
停止继续试图验证韩春雨的实验，不要再浪费时间、金钱、人员和项目。
CRISPR谷歌群针对这项技术和韩春雨的文章的调查表明，140个调查回复中，
只有一个（中国神经所仇子龙？）回答该技术起作用，73个回答无效，63个回答
在验证。
From: [email protected]/* */ on behalf of Lluis
Montoliu To: ISTT List
Subject: [ISTT_list] Great disappointment with Ago: Long life to
CRISPR... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 42 我觉得另外一个思路是在某个Ago的基础上去做mutation screen，看是不是能筛选到一
个在37C能有切割活性的。
不过我个人觉得CRISPR/Cas9已经足够好用了。我做的不多，但是拿到mutants的成功率
几乎是100%，而且筛选的工作量不是很大。我个人没有觉得Ago system会有太多的优势
（当然我也只是个路人，对gene editing领域的嗅觉是非常的不灵敏），不是很值得花
大量的人力和财力去深入挖掘。 |
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k****o
发帖数: 728 | 43 一个glycopeptides，用经典的NaIO4氧化开环形成一对C=O。为了保证氧化完全得在37C
氧化1h，结果peptide产率下降很快，都不知道副产物peptides都跑哪里去了(LC-MS监
测），怀疑是NaIO4氧化的太猛让peptide降解了？有没有更mild的氧化剂或者其他办法
氧化成C=O? |
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j***i
发帖数: 61 | 45 看氧化还原电势啊
DTT的如果我没记错是-330mV
蛋白的二硫键很少有低到-300mV的
pH 7.5-8.0室温一小时足够了
不放心就37C |
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s***i
发帖数: 32 | 46 先谢谢Chihpengc的耐心而详细的解答，我已经把你的解答附在我发的问题的下面了，
这样其他同学看的话也比较容易些。下面是5道FORM3的题，麻烦了。
3-1-10 On the fifth day of a 7-day cruise in the western Caribbean, a 37 yo
woman develops headaches, fever, chills, abdominal discomfort, and watery
diarrhea over a 12-hour period. Many other passengers and crew members have
had similar symptoms. Her temperature is 37C. Abdominal examination shows
diffuse tenderness without rebound; bowel sounds are hyperactive. Her
leukocyte count is 11,000/mm3.Gram’s stain of a stoo |
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s*******d
发帖数: 1079 | 47 STEP1 NBME 5 ANSWERS
Block 1 1 A 2D 3E 4A 5B 6A 7B 8B 9A 10D 11B 12B 13B 14B 15A 16A 17B 18E 19F
20C 21B 22D 23B 24C 25A 26E 27A 28D 29E 30B 31A 32D 33E 34C 35D 36E 37B 38G
39A 40A 41E 42A 43A 44C 45F 46B 47D 48D 49B 50C
Block 2 1E 2D 3F 4B 5D 6B 7D 8B 9B 10B 11E 12E 13A 14B 15B 16E 17F 18C 19C
20A 21D 22F 23F 24C 25A 26E 27D 28C 29D 30E 31A 32A 33B 34E 35A 36B 37E 38E
39F 40E 41A 42D 43A 44E 45D 46E 47D 48F 49A 50E
block 3 1C 2E 3D 4A 5E 6A 7A 8D 9D 10C 11C 12D 13D 14B 15C 16A 17E 18C 19B
20C 2... 阅读全帖 |
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t*****e
发帖数: 3 | 48
If amp resistant plant, the small one is the contaminant one without
the antibiotic selective plasmid.
You can see the small colonies grow up after more than 14-16 hours
incubation in the 37C.
such small colonies usually cicle the big colony.
If you see the cluster of small colonies and well dispersed big colonies,
It may be the result that you have plate out them equally. Insufficient
supplement, the clustered colonies cannot grow as well as they should be. |
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l*******r
发帖数: 39279 | 49 1C,2C,3E,4D,5A,6B,7B,8E,9E,10B,11B,12E,13E,14C,15B
16C,17A,18D,19D,20B,21C,22B,23E,24B,25C,26A,27E
28D,29E,30B,31A,32D,33E,34B,35C,36B,37C,38C
瞎蒙了几个 |
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