z****i
发帖数: 35 | 1 Caspase-1前体分子量是45kD，剪切后变成20kD的和10kD的蛋白，买的两种抗体能够同
时检测前体和p20，做了很多次都是45kD的位置很多条非特异条带，都分辨不出来目的
条带了，不过条带倒是很浓。20kD的则很淡，基本看不见，把曝光时间增加到很长也还
是很淡，若隐若现的。保证加的刺激能活化Caspase-1。
大家谁这个分子比较有经验，能否指点一下怎么才能跑出来20kD的那条带啊？......用
的是sigma和abcam的抗体。
也试过专门跑小分量的蛋白胶，45kD的带还行，20kD的那条带都不怎么成型了，斑斑点
点的，是不是转膜没转好呢？
谢谢啦！ |
|
Z******5
发帖数: 435 | 2 应该不是上样量的问题，我striping后（或者跑的久一点，从45kD处剪开），用beta-
actin杂交，内参的信号已经非常强了，而内源性的c-myc还是很弱。
我用过的两家c-myc的抗体都能杂处很多条带，其中在48-65kD之间有三条条带，转入质
粒过表达显示最上面的条带才是c-myc的（有抗体公司说是表观分子量68kD，有文章说
是64kD，不过所指的是同一条带）。你可以参考这篇文章Nucleolar localization of
hepatic c-Myc: a potential mechanism for c-Myc regulation
关于内源性c-myc杂交很弱的问题，我查过很多文章，多数都是杂带很多，64kD处很弱
。有个别条带很专一，信号很强的，我很怀疑，因为我知道有人拿其它抗体，比如
actin抗体做了个figure，然后说是c-myc杂交的，还发了不错的文章。 |
|
a*******u
发帖数: 19 | 3 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
|
b*******H
发帖数: 830 | 4 多谢！
手头上有一个类似的质粒。不过还是想拿到全序的，45KD左右。学生建议全合成。
能买到最好。 |
|
D**A
发帖数: 311 | 5 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
spec达人能帮忙分析下。
蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
来看，大小应该是45-48kd之间。
切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
希望有人可以帮忙分析下，先谢了。 |
|
