m******p
发帖数: 67 | 1 western for a 25kd protein. using serum.
but the band is clearly at 50kd.
seems dimer, but in sds-page, proteins are denatured, so should not form
dimmer. any suggestions?
thank you very much. |
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c*******o
发帖数: 8869 | 2 if you do IP, you will see heavy chain around 50kd. If it is straight western
blot of tissue lysate, maybe the 50kd band is heavt chain of antibody from
tissue? also, RTK degradation is quite common thing. |
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w**t
发帖数: 52 | 3 We are using the secondary antibody specifically recognizing the light chain
or heavy chain of primary IgG. Let's say our target protein is around 50kD,
we then choose the anti-light chain antibody which only recognize light
chain and show no signal at 50kD (heavy chain). Vice versa.
We buy it from Jackson ImmunoResearch. They have lots of different
antibodies. Such as the goat anti-mouse light chain:
http://www.jacksonimmuno.com/pdf/lots/93358.pdf |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 我们最近在侧cyclin D1 的时候，抗体测出了一个35kD的弱带和一个 50kD 的
强带，而且这两条带在不同的处理里面变化还是不一致的。
想请问一下，那个50kD的是否是已知的磷酸化的cylin D1的形式？
谢谢！ |
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s****9
发帖数: 932 | 5 For an 50KD protein, there is no reason to keep GST. For some peptide
antigen (e.g. 50 peptides), you might consider keep GST in order to amply
the antibody responses.
For removing 20KD protein from 50KD proteins, the first portion I would
consider is 25KD-30KD dialysis.
和其他蛋白分开，进一步纯化？ |
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s*****i
发帖数: 1781 | 6 我用的官网的链接50KD的那个，也被review,不知结果如何 |
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W****C
发帖数: 1937 | 7 2抗当然要识别老鼠IGG. 你可以找个只识别25kd轻链的2抗。
跑native gel可能也会保持igg150kd，减少你样品中50kd的igg重链， 不过总是还有些
的。 |
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p****z
发帖数: 31 | 8 最近直接用1*SDS sample buffer溶解细胞，煮10分钟，13K rpm离心后，在液体表面老
是会有一层白色的不溶物，试过用超声破碎，没效果，打散之后，重新离心还是那样。
换过SDS sample buffer也还是会这样。试图吸出来，一弄就散，然后和溶液混在一起
。细胞在加裂解液之前都有用 PBS洗过。如果样品就这样加进去，会导致vertical
streaking，有时候50kD 以下的lane会连在一起。有人知道这是什么状况吗？或者有可
能是哪些问题？谢谢赐教！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 9 另一个抗体检测不出来也不一定表示就不是那个130kD的降解产物，取决于抗体的识别
位点。
50kD以下有没有明显的条带呢？ |
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g***u
发帖数: 33 | 10 只能看到50KD以上的带，会是咋回事？胶是买的，都正常的 |
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k****a
发帖数: 83 | 11
谢谢了。我的B蛋白是38KD。A蛋白大约是50KD。应该不算大吧。
不好意思，NMR，EPR是什么？我知道FRET。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 我们也觉得很奇怪。
但是那个50kD的带很强，比35kD的强得多。
抗体是 Santa Cruz (sc717) anti-cyclin D1
不知道cyclinD1 immunoprecipitation 是否好做？
如果好做的话我们拿去做一下Mass Spec |
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i*****n
发帖数: 53 | 13 50KD 的带应该是非特异的。 DSC-6 这个Antibody 还可以，但是因为是mouse 来源的，用它做老
鼠的组织，还是会有background. 试了非常多的抗体之后， 我们才发现 SP4 clone(rabbit
monoclonal) 是最好用的。病理医生都用这个做MCL 的检测。 Cyclin D1 磷酸化的形
式离35-36 并不远，非常近。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 14 100mA 一个小时，50kD以下都没问题。 75kD的可以考虑延长到一个半小时。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 15 用E coli表达的GST蛋白，自身约50KD，免疫兔子。是切掉GST好，还是不切好？
还有，最后纯化下来的蛋白里面有一些20多K的杂蛋白，量比较大。怎么把我的蛋白和其他蛋白分开，进一步纯化？
多谢指点！ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 16 你的蛋白50kd+26kdgst，
用millipore的小柱子，50kda cut的离心，小于50kda的蛋白就分开了。
和其他蛋白分开，进一步纯化？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 17 内源性的50kd带出来了？Akt检测还是很简单的，至少在细胞株里。 |
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y******n
发帖数: 8667 | 18 最近出来的胶，总是不能显示大于70kd的所有蛋白。看标准蛋白，发现大分子量的片段
分成数份混杂在小分子量的片段中间。（因为我们用的标准蛋白中的72kd 带是红色的
。可以看到红色分成了３份，混在20-50kd片段中间。）
有没有什么建议，哪里有可能出问题了？ |
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S*********s
发帖数: 304 | 21 60KD nrf2 shows up in 110KD in SDS PAGE.
nobody know the reason for many years.
所以可能性很多 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 22 for some dimers, SDS is not enough to fully disrupt it. |
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t******y
发帖数: 716 | 23 ”using serum“.会不会是因为血清里的IgG Heavy Chain 污染？ |
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b******y
发帖数: 627 | 24 nod. I have many such examples. For instance, I have a 14mer of 10 KDa
protein. But its molecular weight is about 140 KDa on SDS-PAGE. |
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D******9
发帖数: 2665 | 26 add 50-100 mM DTT in your loading buffer |
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b******y
发帖数: 627 | 28 It is a yeast protein over-expressed in E. coli, in which its authentic
binding partner doesn't exist. |
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s*******e
发帖数: 1010 | 29 最大的可能性就是个SDS抗性的二聚体。
SDS-resistant的蛋白多聚体挺多的，老麦的KcsA就是个例子。 |
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m******p
发帖数: 67 | 30 have not tried urea. will try it.
have tried increasing dtt, but not that high. will increase even high.
modification is possible. will try a kit that removes glycosilation.
thanks guys. hopefully will update you with new results. |
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a*******a
发帖数: 4233 | 31 可能有修饰，也可能是蛋白自身交联
前阵子science上的jmjd6就是自身交联，大小是理论值的2倍 sds page破不开 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 32 68kDa.
and sometime 100kDa, sometime 110kDa.
I am crazy with this one.
and most commercial antibodies do not work...
do you have a good one for mouse tissue?
(no H300) |
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S*********s
发帖数: 304 | 33 Because in the past 10 years, people thought that 68KD is the right one.
H300 works at 1:500 to 1:1000.
That's the only one worked in my hand. |
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m******p
发帖数: 67 | 34 then, how did people know the band at 110kd is jmjd6? |
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H*g
发帖数: 2333 | 35 How did u boil the sample before loading on SDS-PAGE?
Do u think if this step could affect the molecular weight of the observed
band(s)? |
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m******p
发帖数: 67 | 36 i boiled it for 5 min.
a website says no boiling can remove dimer, so i tried no boilding, but
still the same result. |
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C*******I
发帖数: 151 | 37 有时SDS不足以解开oligomers。多加些SDS(1.5%)和beta-mercaptoethanol（4%）。然
后在90C加热10分钟试试。 |
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f******9
发帖数: 39 | 38 How about -S-S- linked dimer? |
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s*******e
发帖数: 1010 | 39 1. 我做过最大的是40kD vs 50kD，其实最重要的是解离常数，太高的话恐怕pull-down
的敏感度达不到；
2. 超声丢蛋白不太常见，你确认超声时候保持低温了吗？有时超声带来的高温会使蛋
白质变性；
3. 有可能是纯化条件没有优化好，有兴趣的话可以找个你们实验室做的成熟的His tag
蛋白做阳性参照试试你的纯化操作和试剂盒，或者换Qiagen的NTA或Clontech的talon
resin试一下。
祝你好运 |
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n********e
发帖数: 1630 | 40 大家好，
有个western transfer的technical的问题。我们lab用的是一个很笨重的biorad的semi
-dry transfer 仪器。我刚开始做western，transfer的效率总是很差。
protein ladder用的是5ul，
manual上推荐mini gel，8.5cm x 5.5 cm，用10v-15v，30min
我开始用过25v，总是看到有的ladder 到了下面的filter paper上面，同时还有ladder
在gel上面，如果时间长点，gel上就看不到ladder。
后来我用15v，推荐的，40min-60min，还是看到有ladder在gel上面，但是没有在
filter paper上面。说明这个voltage很合适的，不会over transfer。但是高分子量的
ladder， 50kd以上的，总是转不完全。
我的protein只有20kd，理论上根据ladder来看，应该都转过去了。可是我的western跟
同样的sample，在其他lab做的，结果就不一样。抗体都是按照他们的catalog number
买的。但是dete... 阅读全帖 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 41 我想测两个endogenous protein interaction
protein A 25 KD, protein B 50 KD,
想用 protein A 作 IP, WB to 检测 protein B.
手头有两个蛋白的抗体, 都是 mouse IgG.
问题是,protein B正好是 50 KDa, 和 mouse IgG的重链正好重合, IP和WB如果都用
Mouse的抗体,50KD 抗体就会带来很强的信号,使得无法检测 protein B的信号.
请问 Co-IP 高手, 这种情况如何解决?
谢谢 |
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c*****n
发帖数: 19 | 42 如果只要小量无蛋白溶液，上浓缩蛋白用的带滤膜的离心管，取离心后的flow through。
如果里面蛋白只有albumin，用30KD/50KD的浓缩管；如果要保险，用3KD的也行。
概2 |
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m******f
发帖数: 25 | 43 想用分子量为50kd的大分子物质处理3D培养的细胞，将大分子物质溶在培养基中，不知
道能否穿透matrigel 与细胞接触。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 44 搭车问专家个问题：
我想检测一个大约50kd蛋白Trypsin降解后的所有Peptides，直接跑MS，还是最好走LC-
MS/MS?
大概有40左右的片断，肽段大小都在200-4000 D。
刚做了一次试验，拿到些数据，正在琢磨怎么分析。 |
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l********s
发帖数: 70 | 45 我做CoIP， IP检测的蛋白size 和IgG size 刚好都是50kd 怎么办？？
谢谢大家了！ |
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