W*******a
发帖数: 1769 | 1 You need to understand how Illumina seq works. Two ends of the
library molecule anneal to two oligos on the slide, forming
a bridge, and a PCR is performed in situ to amplify this molecule
into a cluster. The efficiency and consistence of cluster forming
is limited by the size of the insert, you can't have very long
product (>1kb)
classical pair-ends are generated directly from short inserts
usually less than 1kb, so no special library preparation method is
required.
For mate-paired, the t... 阅读全帖 |
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c*******y
发帖数: 161 | 2 我电转过DNA片段到大肠杆菌细胞,用的是Bio-Rad的仪器,只是设定电压2.5KB,其他条件
不用设置,效果很好.还有制备好的电转感受态细胞很重要的.我的意见仅供参考. |
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H****s
发帖数: 301 | 3 有两个建议：
（1）改双酶切连接为单酶切连接。载体要处理好。
（2）使用DH10B感受态。或者是类似的RecA-菌。
我做的插11kb到5kb的载体上去，基本上都成了。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 4 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
Nice alternative, shall solve the problem in this case...but I would just do
blunt ligation, nowadays, the fast ligation kits from different companies
such as Roche, takara, don't really care about whether it is sticky or blunt
ends, it works just as well...BTW, any one else ... 阅读全帖 |
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p********o
发帖数: 29 | 5 这个组合至少对于我而言很好用，而且对于5kb以下的克隆几乎100%的准确率 |
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v***a
发帖数: 1242 | 6 要克隆一个gene，发现用我自己培养的细胞来PCR扩增时，大部分P不出，少数P得出。
用别人养的相同的细胞，都P不出。凡是P出来的，会有两条靠得很近很近的条带（~1.
5kb）。
然后我就挖了上面的那一条下来，做成plasmid了，测序也都完全正确。
这次要做recombinant protein，所以重新设计了primer（PCR产物很短，只有600多bp
），用上次做的现成的plasmid进行PCR，结果又P出来两条很近的条带。
有点想不通，请教一下大家这是怎么回事呢？
另，做western blot时偶尔也出现靠得很近的条带（忽而又只有一条），没有见过有相
关isoform的报导。
谢谢！ |
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k*****u
发帖数: 14053 | 7 最近做一个克隆
2。5kb得转到topo vector里
然后电转进一个ecoli cell， which has a temperature sensitive plasmid already
然后只能在30度长， 2个抗性
板长2－3天
streak for single colony
然后挑single colony 进液体
28度长2天
做小抽 （qiagen）将近20个sample了每次只有10－16ng/ul in total 30ul
正常么
告知师兄（埃及人）
说了我不觉得自己手有问题 以前都抽过其他得还有大抽genomic dna 都没问题
结果他offer明天和我一起做小抽
唉 |
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s***o
发帖数: 1189 | 8 请问测序高手，
construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序？？
课题需要，在construct里构建double sequence （～2.5kb）。测序遇到麻烦。
谢谢 |
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s****9
发帖数: 932 | 9 I am also doing in situ with DIG probe. None of the probes from my designs
show any signal while other probes from other lab works very well as
positive control. Do you have any suggestion for probe design?
The mRNA is 1.5kb. I desgined three probes, full length, C-terminal half (
700bp), and N terminal half (700bp). |
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z*y
发帖数: 84 | 12 已有现成的primers和已经建立的试验方法，但是其中的PCR是普通PCR。组里以前的工
作即使用普通PCR，仍然能够清楚的反映出所比较样品的差别。而我现在这次不行，一
是可能本来就没有差别，也可能是差别不大，比如＜10倍的差异，这时普通PCR就不能
有效的反映出这种差异。所以我想有没有定量PCR的方法，利用已有的primers来检测两
个样品间是否存在差异。
看来好像不行。不过还是谢谢楼上两位。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 13 promoter区的主要困难在于一般GC content都比较高，所以需要特殊的酶和buffer，这
个版上之前应该讨论过多次了，好几种候选。
BTW，转录起始位点上游1-2kb基本上就涵盖了绝大部分的TF binding sites了（当然特
例也有），所以一开始别太贪心，一上来就打算P个5kb什么的，那就没谱了。
此外，序列已知的话，直接合成序列也是一个办法，如果实在弄不出来 |
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n***w
发帖数: 2405 | 14 could be, mine is about 2.5kb. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 promoter reverse和gene forward吧
10bp overlap是不是有点太短了
相对于你两个片段来说（一个1.5kb一个3kb)
这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
一般要摸条件优化的
很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
等前几个循环产生足够多的full length template以后
再放两端的primer进去
如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
做TA cloning出不来不奇怪啊
如果你确定有终产物的话
我建议是胶回收以后再做TA cloning
不然乱七八糟东西太多了 |
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j*p
发帖数: 411 | 17 1. UCSC genome browser has many ChIP-seq tracks including TFs, Pol2 and
Histone modifications (H3K4me3, H3K27me3, H3K36me3, etc) on different cell
lines(through Encode/Gencode project). You can just active these tracks and
compare with what you have to see if your H3K4me3 data looks normal or not.
2. I suggest you normalize your ChIP-seq signals. For example, your normal
tissue ChIP-seq has total number mappable reads = 10M, your tumor sample has
20M mappable reads, then divide any signal from t... 阅读全帖 |
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C*********m
发帖数: 213 | 18 质粒本身7.5kb左右 加两三个1000a.a.的基因总长度超过15kb-20kb
phenotype层次说top10有mcr突变，转甲基化的DNA容易一些。DH5alpha没有看到。 |
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e***o
发帖数: 344 | 19 polycistronic expression因该还是一段RNA吧？ 我想弄两段RNA。
2段RNA加起来超过5kb了，AAV应该不好弄了。 |
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B*********r
发帖数: 19 | 20 TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
接？
用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 21 How much to synthesize 5kb DNA? |
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s********8
发帖数: 619 | 22 又测序了一个克隆,目前为止没有突变.看来还是polymerase的问题.
问题是这个基因有2.5kb,还得接着测,但愿没突变了. |
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Z******5
发帖数: 435 | 23 多谢楼上两位。
病毒最后包装的部分应该是HIV-5'LTR到HIV-3'LTR之间的部分吧。pll3.7载体上这部分
大小是5kb，我改造后大小是6kb。我要分别构建两个转录因子的载体，一个是500bp，
另一个1.4kb。我想应该没什么问题。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 24 拿质粒作模板，而且还只有1.5kb，基本上闭着眼也能扩增出来的，呵呵。直接2-step
PCR，不用退火，变性后直接72度延伸，可以有效减少引物二聚体的影响。前提是引物
Tm值均高于72度（这个应该不难） |
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F*K
发帖数: 608 | 26 is there a place to buy whatever gene you want? |
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l*****i
发帖数: 1163 | 28 可以从openbiosystem买，或者harvard plasmid买 ，后者更便宜一点 。
Origene有几乎所有的基因，但是贵的离谱。
如果非要自己克隆，建议分段。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 29 如果是人活着老鼠的基因，记得indiana u还是哪里有一个facility,
大多数都有，clone在pDown里面，好像也就$100一个 |
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s******s
发帖数: 13035 | 30 我觉得PCR不是问题，尤其是用phusion。可能copy number太少，
RT做的质量不高，所以全长模版莫有啊 |
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c*****n
发帖数: 233 | 31 老板想要的isoform，网上没看到有现成的。 |
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h******u
发帖数: 131 | 38 elongation time need 2min/kb. Did you keep you elongation time 10 min each
cycle? |
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s******s
发帖数: 13035 | 39 taq 1min/kb, phusion 15sec/kb，不知道你说的啥酶 |
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a******c
发帖数: 597 | 40 这个好办。增大mRNA的量，逆转之后，换不同的high fidelity 酶，不同条件pcr，一
定能pcr出来。 我以前遇到过一模一样的问题。 |
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c*****n
发帖数: 233 | 41 增大到多大算大。我的mRNA的浓度是差不多40ug/ml. |
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a******c
发帖数: 597 | 43 Takara PrimeStar polymerase. |
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a******c
发帖数: 597 | 45 Takara, prime star polymerase. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 RT用的什么酶？
我觉得RT的酶比下游PCR用的酶更重要 |
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h******u
发帖数: 131 | 47 pfu 2min/kb 是比较保险的。我扩过13KB的。条件是 26min elongation each cycle.
之前用16min each cycle 做过两次，都失败。 |
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c****l
发帖数: 1086 | 48 Did you try nested pcr?
what do you mean by failure? could not detect it? |
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s******s
发帖数: 13035 | 49 个人觉得pfu是个垃圾酶，高保真没问题，扩增效率太低，速度太慢。
我基本上认为phusion是最好的了，基本上clone都用这个，难办出不来
的换HiFi Taq试试运气，做screen的时候用homemade Taq
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n********k
发帖数: 2818 | 50 a couple of questions:
1. Are you very experienced with molecular biology? no offense, u sounds a newbie to me...So a control question here: can you successful do other
short-ones say1-2kb or even less easily with the protocol...
2. do you know the exact sequence of the isoform(s), or you are trying to
use primers on the two extremes to fish out any possible isoforms(known or
unknow)?
3. With that, check your sequence complexity bioinformatic...anything
peculiar with your sequence?
4. if 1 and... 阅读全帖 |
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