s*******e
发帖数: 17 | 1 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
抗体做western检测药物处理前后
的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
常明显。从分子量判断，这个条带
肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
不到那个70kD分子量位置有蛋白变
化。
我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。 |
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s*******e
发帖数: 17 | 2 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。 |
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d****7
发帖数: 109 | 3 我现在也有类似的情况，可能是抗体的问题，比如我现在用的一个Cell signaling的
FOXO3a抗体，
在大概90kD有条带，在70kD也有条带，70kD那条带的表达量随细胞周期变化，90kD那条
带却很稳定，
而Cell signaling网页上的图却只有恨特异的一条带。呃。。。 |
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a******1
发帖数: 116 | 4 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
么解决方法呀？多谢
另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带 |
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r******g
发帖数: 600 | 5 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
transfection）.
... 阅读全帖 |
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a****c
发帖数: 339 | 6 Do you have a way to keep dextran while doing permeablization ? I'm researching on this all afternoon.
I'm thinking about using 70kD dextran. |
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t****p
发帖数: 1504 | 7 一般这种情况不值得深究。一个药物处理之后，显著变化的蛋白和mRNA不计其数，只是
恰巧有一个被你的抗体识别了。
用这个蛋白A的抗体的抗原序列做个搜索，先看看有没有大约70kd的同源蛋白。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 8 albumin有70kD哦
不算小哦。
应该选烟草，烟草转基因比较容易。而且可以种水稻的地应该用来种粮食，只能种烟草
的地，用来表达可用的动物蛋白才是废物利用。 |
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S******e
发帖数: 393 | 9 一个蛋白有没有可能有多个binding sites 与另一个蛋白binding？
我将蛋白A分成4段(no overlap)去做与B的binding,结果显示只有蛋白A的C端那个fragment与B没有binding, 其它3个fragments都与B有binding,这可能吗？
还是我IP有问题？ (A的每个fragments都约70kD以上)
顺便再问一下大家做co-IP都用多少总蛋白以及binding多久？
非常感谢！ |
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y******n
发帖数: 8667 | 10 最近出来的胶，总是不能显示大于70kd的所有蛋白。看标准蛋白，发现大分子量的片段
分成数份混杂在小分子量的片段中间。（因为我们用的标准蛋白中的72kd 带是红色的
。可以看到红色分成了３份，混在20-50kd片段中间。）
有没有什么建议，哪里有可能出问题了？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 问题是你用actin antibody 看到的那个70kD带未必是真的GFP-actin |
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w*******r
发帖数: 23 | 12 应该不是marker的问题，质谱分析结果里丰度排在那个70KD蛋白下面的就有一个60KD左
右的蛋白还有一个50多KD的蛋白。如果从跑胶结果看的话，那个切下来的条带离70还很
远呢，不可能有70多KD。Anyway, 谢谢回复啊。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 13 70KD的蛋白可能跑低了，60KD的蛋白有可能跑到80KD啊，这个不能一概而论。如果你切
的没错，质谱的结果就靠谱
pull |
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w*******r
发帖数: 23 | 14 如果是这样的话，难道这个药同时结合了至少3种蛋白？！因为这个70KD的蛋白和另外
两个60KD的蛋白在control里完全没检测到，只在pull down里才有。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 15 70kD band might be DnaK
it's very normal to copurify the molecular chaperone when you try to purify
those overexpressed fusion proteins
to remove DnaK, you can add 5 mM ATP and 5 mM Mg2+ into lysate and incubate
for 20 min at room temperature prior to purification (i.e., before loading
onto the affinity column) |
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h*******o
发帖数: 4884 | 16 差距太大了
《30kd的干干净净， 70kd的就一堆转不过来， 和普通的wet tank比差距明显，时间倒
是非常短 |
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d*******w
发帖数: 45 | 17 看到大家说的这么热烈，对这个领域的一些东西有点了解，补充几句。
cheng的发迹主要得益于最新的camera，DDD，K2系列。cheng属于前几批和这个仪器打
交到的组了，貌似是因为开发这个camera的公司需要UCSF有人帮他们测试这个仪器。
DDD这种camera的精度和敏感性都比现在通常采用的CCD要高了不知道多少楼。通俗来说
，CCD可能需要1-2秒左右的曝光时间才能得到比较好的图像，但是DDD可以一秒内得到
40-50张的图像。Cheng之前在Nature methods上发了一篇文章就是关于用DDD可以提高
质量的文章。之前，在用cryo－EM照相的时候，人们对于电子光束是否会导致物体的
drift是很有争议的。DDD出来以后，cheng和一个MRC的组就发现了，电子光束确实能够
导致drift，他们通过把一定时间内同一区域的照片进行修正，发现能够在很大程度上
提高图像的质量。在DDD出现之前，主要是通过CCD来收集相片，然后从中挑出几万个蛋
白particle进行平均，得到3D，这种方法极其枯燥，也非常耗时。但是DDD出现后，得
出一个3D就只需要几千个particle... 阅读全帖 |
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r******g
发帖数: 600 | 18 这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
没问题～
westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
然后一个很粗的 upper 70kd的band
因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
code |
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