h***e
发帖数: 146 | 1 DNA浓度不要太高
0.7%足够啦，我都分开过2.7和2.8kb的
YHID |
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s******r
发帖数: 2876 | 2 A or B单切的话是多大，7.8kb？跟空载体比过吗？
我核实过这个质粒的测序结果，序列包括酶切位点在内没有问题。
质粒5.6KB，insert 2.2kb。 |
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b*******0
发帖数: 125 | 3 多谢楼上的几位达人 相助。
to2楼，
我用24孔板做，只能看到几个零星的绿点（GFP），
to4楼，
我要转的基因片段达8KB，有什么好用的病毒载体推荐吗？
多谢啦！ |
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j**********0
发帖数: 391 | 4 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
问题。
如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
多谢。 |
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j**********0
发帖数: 391 | 5 那工作量太大了，而且效率低，8kb，100个case。还有好办法吗？ |
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f*******2
发帖数: 14 | 6 Recommend using PacBio sequencer. multiplex all 100 cases with barcodes, PCR
amplify the whole 8Kb. A single smrt cell can generate enough sequence data
for the mutation detection. better than regular Sanger sequencing.
Contact me if you need more info. |
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W*V
发帖数: 13 | 7 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集我30年的分
子生物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb),
无论酶切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权
关系 (正在写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.
为证明其可信度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你
克隆好的质粒. 有兴趣的话,可联系,用此邮箱. |
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W*V
发帖数: 13 | 8 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集30年的分子生
物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb), 无论酶
切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权关系 (正在
写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.为证明其可信
度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你克隆好的质粒.
有兴趣的话,可联系,用此邮箱. l******[email protected] |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 谢谢楼上各位
我有加了和不加DMSO的对照
也有试过10，20，30，40，50ng template/50 ul reaction
引物有用过Strategen protocol上说的完全互补的
也用过Zhang et al, 2004 Nucleic Acid Research上发表的要不完全overlap的
奇怪的是35个循环出了产物但是都跑well都在胶里
降到18个循环就什么都没有了
但还是转录了，完全没有克隆
重新设计引物什么的18个循环倒是有产物了
但是好多非特异带
只胶纯化8kb的那个带，往下做，没有克隆
想问问大家一般引物终浓度用多少？
PCR条件是根据引物用不同的anealing还是统一用SDM protocol里面的55度，
或者Zhang文章里的52度？ |
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s******r
发帖数: 1245 | 10 确定整个packaging system是work的？有没有弄个小的gene进去包包看
我们经常包4-5kb的插入，titer低点但是能包出来，不过你这个加gfp要7kb多快8kb了 |
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j******i
发帖数: 939 | 11 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
ligase, Gibbson Assembly. |
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r******g
发帖数: 600 | 12 我试过1.25ug DNA 其他的都一致～ 也work fine
我的plasmid 8kb |
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 15 最近导师让我包装很多腺病毒， 其中有一个基因很大，8kb，另外再加上启动子和GFP
，整个加起来快10kb了，。。。我记得腺病毒的transgene packaging capacity 不超
过8 Kb。请问各位老师我这个快10kb的片段能用腺病毒包出来吗。。。。？最后结果是
我压根儿就得不到病毒还是说可以包装出病毒但是病毒的效率特别低？谢谢啦。 |
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c***s
发帖数: 3 | 16
不会吧？！Windows下串口也没有这么菜呀？敢问您用多快的速度？我曾用过
115200bps的速度双向同时通讯，连续超过10分钟，Windows没有倒闭．
不过当然只运行通讯程序，如果同时还运行其他软件，Windows可能
忙不过来会产生缓冲区溢出错误．
我是用Visual C++直接使用Windows创口调运，并将创口缓冲区设置
为8KB使用的．而且做测试时，同时使用两个串口工作于115200bps
全双工状态下．Windows的实时性不太好，但和DOS系统是一个级别，
都受1/18.2=55毫秒的定时限制（Windowsw的定时虽可以到1ms，
但那是非实时的，它会到55ms时来50个消息）．
要用强实时性，只能用BIOS调用或直接硬件编程，而且一般说来需要
同时对串口和时钟芯片编程．（会死得很惨的！）
要在DOS下编，可以使用DOS系统调用（忘了是几号了，25H？）
还是找本Windows通讯编程的书看吧！呵呵．．． |
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c*****o
发帖数: 310 | 17 比如d cache 从4kb 增加到8kb
这个4kb是如何计算出来的？ |
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a****l
发帖数: 8211 | 18 Assume your sampling resolution is 32bit(which is insanely high), you have
4B*20Hz*100=8KB/S=64bkps. adding 29bit header (which is the longest) for
each message, you need approximately 128kbps. Assuming you are using 250k
CAN (which is a mid-range speed one), doesn't seems to have much problem
since the load is only around 50%.
sampl
p
5
somethin
included |
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w*******y
发帖数: 60932 | 19 Link:
http://www.amazon.com/gp/product/B003WGJYCY/ref=cm_rdp_product
Best price I can find for an excellent brand of 32gb Micro sdhc card. If
you know of a better deal I'd be happy to hear about it. Sandisk doesn't
specify class on the non-Extrume/non-Ultra drives, but users report
obtaining speeds faster than Class 4:
"I've used a benchmark app on the phone to gauge performance of the card,
and it is doing about 5MB/sec writes and 9MB/sec reads. This is with
settings at 10MB test data size an... 阅读全帖 |
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r****t
发帖数: 10904 | 20 替代方案用 asterisk + ata 的话：
1. 有来电显示，也能设打出时候的 caller id.
2. 能同时打出第二路电话（如果插了两个电话机）。
3. 有 asterisk 语音信箱。也可以选择完全用 google voice 语音信箱。
基本 ooma 就是个传说通话质量好，但是现在 upload 带宽都很充足，只要 > 8kB 的
话 ulaw
的语音完全比 ilbc 听起来好, ilbc 压缩太厉害，只不过对丢包不敏感而已。说 ooma
语音质量
好是靠不住的。 |
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L*******r
发帖数: 1011 | 21 QNX可以当Desktop用的，功能上不会比vxworks少的。QNX本身是posix兼容的。基本上
通用的UNIX程序都可以移植过来。
>> 微内核结构(最小结构<8KB)
hmm... vxWorks is smaller, but can't be called "microkernel". MicroKernel
has special meaning. http://en.wikipedia.org/wiki/Microkernel. QNX is microKernel even it is bigger than the smallest vxWorks. hehe.
>>包括多任务调度采用优先级抢占方式
For RTOS, this is bad. hehe.
were
the
performing
only
equipped |
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