m***o
发帖数: 272 | 1 IGF1 mw 17kd，mature protein 8kd。
说检测不到不准确。就是最高的是48h 10moi时可清楚看到17kd，看不到8kd。但是在
48h 5moi时17kd条带很淡。72h时17kd都十分的淡。mature的8kd蛋白都看不到，跑的20
%gel。
Qpcr可检测到mRNA的表达。是蛋白都分泌出去了吗？但是细胞内多少也该有啊？
有谁做过分泌蛋白的表达吗？什么看法？ |
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r****o
发帖数: 105 | 2 本文献给YL
（二十三）正相与反相
我们纯化出钙调蛋白之后，就开始进行一些蛋白质化学的分析。主要是蛋
白酶消化，反相HPLC分析，MALDI-TOF质谱之类的分析。我觉得在这个课程
里面加一个质谱分析并不是那么有用，因为基本上只是演示实验，只是讲了讲
皮毛而已。相比之下反相HPLC在蛋白质纯化中要重要得多。
HPLC的全称是High Performance Liquid Chromatography （高效液
相色谱），这个名称听起来好像很尖端的样子，其实HPLC组成部件非常简单，
主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC跟一般的色谱的一个显
著不同是压力。为了保证纯化蛋白的分辨能力，反相HPLC柱的matrix材料颗
粒非常精细，所以必须施加很大的压力才能跑得动柱子。相比之下，反相HPLC
所需压力比一般gel filration柱子压力大十倍都不止。反相HPLC的分辨度十分
惊人，远远超过其他色谱方法。分辨度高到什么地步呢，我举一个自己的例
子。我原来在E.Coli里面表达EGF repeat，大概有7到8KD的样子，然后用体
外反应加上一个fuc |
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y******8
发帖数: 1764 | 3 The protein G B1 domain is about 8kd, and would be hard to synthesize.
Pratically, this is the only reason you need to ask for the material and
permission to start. Otherwise, you could just do it and wait for response.
Usually, people don't pay attention to nonprofit stuff. |
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S******e
发帖数: 393 | 4 用tris-glycine也可以吧，准备用10-20%的gel, 0.2um的nitrocellulose membrane,
湿转100V, 1 hour可以吗？
从没用过tris-tricine，有什么好处？
THX! |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 tris-glycine可以。
但是最好不要用高电压转。不然蛋白很容易直接穿过膜导致可检测的量非常低。
建议用30伏，4度，转过夜。 |
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S******e
发帖数: 393 | 6 多谢！下次就用低压转。已经跑了一次胶，高电压转的膜，检测的信号的确非常弱。
除了低压外，如果用0.1um的膜会不会效果好很多？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 0.1um的PDVF膜会更好。
另外，可以把甲醇浓度调高一些。可以调到30~40%。最低也得用20%。 甲醇的功能是：
1。洗脱蛋白上多余的SDS，让蛋白跑得不要太快； 2。让蛋白充分变性，能和膜结合得
更紧。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 10
请教一下30V， 4C，overnight和110V， 1.5h的transfer有什么区别？我从来没做过前
者，觉得时间太长了，western做完要好几天。不知道有什么有点没有？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 30V， 4C，overnight对于无论是大蛋白还是小蛋白都比110V 跑几个小时出来的条带明
显的强很多。
对于中等大小的蛋白则差别不是特别大。
时间会长不假，就看你们更注重什么了。我们经常要做一些含量很低的蛋白，我的一个
博士后用他以前实验室的习惯用110V跑，得到的带非常模糊。我让他改成30V， 4C，
overnight，效果立马不一样。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 Bio-rad的不错。不过我们只用过他们的，没有和别人的比较过。
另外，PVDF膜用起来还是相当麻烦的，需要事先用甲醇浸泡。转膜的时候甲醇不能太低
，而且背景还容易偏高。所以没啥特殊原因不推荐。 |
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t****t
发帖数: 86 | 13 我转小蛋白，看你上面建议0.1um PVDF膜。
另外bio-rad没有0.1um的膜啊。只看到whatman有
【 在 tyzhet (开吉普的金田一) 的大作中提到: 】
: 有不有推荐的 0.1um PVDF膜？ |
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m***o
发帖数: 272 | 15 可能没表达清楚，现在是想确定这个病毒确实可以表达IGF1，因为已经注射给老鼠，没
看到明显的体重变化，所以做细胞确认一下。因为买的病毒，直接就给老鼠了。
血清也做wb，什么看不到，也做了老鼠的liver tissue，也是什么都没看到（不论17kd
还是8kd），所以比较疑惑。细胞怎么48小时有表达（只有17kd），72小时反而没了？
比较确定实验中没有犯低级错误，比如加的不准什么的。 |
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