|
a******1
发帖数: 116 | 2 我觉得应该是真的，绿色荧光看得很好，而且western的背景也比较干净，条带也比较
清楚 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 3 你是说长暴光的时候看到那个弱带的时候背景很干净么？
我以前试图过类似事情，但是发现那个弱带的信号比实际的蛋白的量少。就是说，
虽然看起来非常少，但是真实的量似乎没有那么少。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 4 你是说长暴光的时候看到那个弱带的时候背景很干净么？
我以前试图过类似事情，但是发现那个弱带的信号比实际的蛋白的量少。就是说，
虽然看起来非常少，但是真实的量似乎没有那么少。 |
|
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 7 就是细胞膜底下堆着高高一堆actin 把膜都拱起来了。 |
|
F*Q
发帖数: 3259 | 8 我觉得那个人的遭遇比我遭遇的要好得多，比如说 the association of actin and
the bacterium 本身并不是他的主要研究对象，只是当他看到同事做的东西偶尔想到那
种可能性而且还被证实了。这种事例说明他确实有洞察力，既然他有那么强的洞察力，
他在自己主攻的方向应该很容易做出高人一等的成绩来，他也用不着去抱怨别人强了他
的idea. 我的遭遇是，我不止一次完成了别人做不了的课题，但因为结果不支持那些烂
人们以前发表的垃圾文章里的结果而被他们压住不让发表。还有最近的遭遇就是在我面
试目前这个实验室的时候，我一再追问现在的老板哪里有实验设备可以完成他计划让我
做的课题的时候，他在光天化日之下对我撒谎，说可以到什么大学去收集数据，（后来
才发现）比当时早几年人家就不再让他实验室去用那台仪器了。
我也多次说过，造成我这种遭遇的根源是体制的黑暗面，这种体制给予了老板太大的权
力，老板一方面具有对课题结果的绝对控制权，另外一方面还掌握了手下人的前途。如
果一切符合老板的利益，体制自然不是问题。如果和老板的利益不一致，体制的黑暗面
就dominate. |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 9 Water world 被轰出水来啦 哈
sunny 这身装束
BTW sunny 把人家 岩佐mm PI 收成压寨的如何
搞的都是 激动蛋白类 哈
Janet Iwasa received her Ph.D. from the University of California, San
Francisco working on actin cytoskeleton dynamics with Dyche Mullins.
she joined the faculty at Harvard Medical School in 2008.
http://cellbio.med.harvard.edu/faculty/iwasa/ |
|
|
v***a
发帖数: 1242 | 11 有点啊。高密度下看细胞核都变小了，平时用20x看正好，现在得用40x甚至更高 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 12 LZ
please refer
Xu Y et al. (2010)
Connective Tissue Growth Factor in Regulation of RhoA Mediated Cytoskeletal
Tension Associated Osteogenesis of Mouse Adipose-Derived Stromal Cells.
PLoS One. 5: e11279.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20585662
its Fig. 2 B d |
|
|
|
|
b******y
发帖数: 627 | 16 what is the dimension of the two figures? Are there many cells or it is part
of a single cell? Is the right one stress fiber? Maybe different small
GTPase, (Rac1, Cdc42 or RhoA), are activated in the two scenarios. |
|
v***a
发帖数: 1242 | 17 hi sunnyday 非常感谢你的详尽回答！
是的，左边的怎么拍都丑。你能再解释一下为什么顶起来的细胞就会造成成像质量差呢？
我养的是一样的贴壁细胞……左边的情况是第一次见到。。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 18 因为细胞顶起来之后就会比较厚，各个在空间上不同高度分布的光全部都进入
你的显微镜镜头，造成成像模糊。
一般解决方法是confocal microscopy or convolution microscopy
呢？ |
|
|
l**********1
发帖数: 5204 | 20 you can be a PD of sunny lab later if both side are satisfied. |
|
b******s
发帖数: 5365 | 21 赞Sunnday!热爱做confocal的本人从此要做你的扇子了，以后还请多多指教！ |
|
m*****l
发帖数: 28 | 22 Publication 惨不忍睹， Pubmed: Gray NW
3篇first－author文章。2005年的文章Figure 5还是错的，2003年的文章Figure 3 ps
的不行。
不是这个领域的，看不出来造假没有。
谁要是找出来我给谁发包子。
奇怪了，这样的人怎么能当上Nature的editor去把握这个领域的最前沿。
A dynamin-3 spliced variant modulates the actin/cortactin-dependent
morphogenesis of dendritic spines.
Gray NW, Kruchten AE, Chen J, McNiven MA.
J Cell Sci. 2005 Mar 15;118(Pt 6):1279-90. Epub 2005 Mar 1.
Dynamin 3 is a component of the postsynapse, where it interacts with mGluR5
and Homer.
Gray NW, Fourgeaud L, Huang B, Chen J, C... 阅读全帖 |
|
l***y
发帖数: 4671 | 23 correlation 和一般的 clustering 不是基于机理的，哪怕像 GSEA 那样做
annotation 上的 enrichment 也不够过瘾。而且 correlation 的 assumption 是线性
，处理实际数据时往往不是很管用。图是指各种调控网络。在图上做 clustering/
enrichment 来得到新的机理。关键节点是为了验证图模型是否正确，验证所揭示的机
理是否正确，同时也提供新的靶位。
另外，这个不是我在做的，虽然有些类似。是我们的一个 competitor 在做，而且已经
做完了，正在写 paper。就是用来举例说明一下当前比较常见的做 systems biology
的套路。
这个领域，数学家并不可怕，可怕的是每天自己抽蛋白抽RNA做转染杀耗子的数学家。
听 seminar 时，经常鄙视那些做纯 simulation 的组的异想天开和不靠谱，也不怕那
种跨学科的强强联合，就怕看见那种说我们要做这个 computational model，所以我们
构建了某某新 reporter/mouse model of xx disease/novel... 阅读全帖 |
|
l***y
发帖数: 4671 | 24 correlation 和一般的 clustering 不是基于机理的，哪怕像 GSEA 那样做
annotation 上的 enrichment 也不够过瘾。而且 correlation 的 assumption 是线性
，处理实际数据时往往不是很管用。图是指各种调控网络。在图上做 clustering/
enrichment 来得到新的机理。关键节点是为了验证图模型是否正确，验证所揭示的机
理是否正确，同时也提供新的靶位。
另外，这个不是我在做的，虽然有些类似。是我们的一个 competitor 在做，而且已经
做完了，正在写 paper。就是用来举例说明一下当前比较常见的做 systems biology
的套路。
这个领域，数学家并不可怕，可怕的是每天自己抽蛋白抽RNA做转染杀耗子的数学家。
听 seminar 时，经常鄙视那些做纯 simulation 的组的异想天开和不靠谱，也不怕那
种跨学科的强强联合，就怕看见那种说我们要做这个 computational model，所以我们
构建了某某新 reporter/mouse model of xx disease/novel... 阅读全帖 |
|
b******i
发帖数: 287 | 25 我很小白，只是好奇：
为什么Lane 1没有Actin的带？
Load少一点样品，会不会没有这么弥散呢？那团dimer很浓啊。。。。
你做的LT的是根据文献做的？Reducing Agent你指的是什么啊？beta-ME or DTT? 这些
不是通常只是打断二硫键的么（如果我错了别笑～～）？你的Dimer是由二硫键所形成
的么？我曾经跑过一个Non-reducing的Gel，不加bete-ME or DTT，同样用高温处理过
，也可以跑出很好看的带型啊。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 26 没做过NGS，但是看过一篇cell paper：A Mammalian microRNA Expression Atlas
Based on Small RNA Library Sequencing，再结合一些已有的miRNA文献研究，感觉这
个NGS的数据质量非常高啊。
不清楚NGS那些miRNA的copy数是怎么来的，有没有用内参，用的是什么内参。
反正普通qPCR就用GAPDH，actin之类的做内参貌似不是很靠谱。
现在有一些qPCR array，都会带有结果计算软件，可以从array的分析中自己去选定内
参。 |
|
b******y
发帖数: 627 | 27 Interesting. It is easy to prove or disprove whether it is actin filament or
microtubule. If neither, it should be certain kind of intermediate
filaments.
Since you are doing IF, can you pull this complex out using protein G beads
and then MS ID? |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 28 Standard error of mean (SEM)
Dynamics of cortical actin in budding yeast Saccharomyces cerevisiae
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
Der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilian-Universität München (2010).
web link:
Http://edoc.ub.uni-muenchen.de/11423/1/Yu_Haochen.pdf
or
Higgs PG
Error thresholds and stationary mutant distributions in multilocus diploid
genetics models (1994)
Genet. Res. Cambridge 63: 63-78.
web link
//siba.unipv.it/fisica/articoli/G/GeneticalR... 阅读全帖 |
|
S*********s
发帖数: 304 | 29 make sure you are using recombinant protein not cell lysate.
Otherwise it is too complicate |
|
S*********s
发帖数: 304 | 30 make sure you are using recombinant protein not cell lysate.
Otherwise it is too complicate |
|
S*********s
发帖数: 304 | 31 还有sunnyday说的这种可能性。
可以直接用买GSSG，sigma就有，in vitro incubate,可以exclue or confirm this
possibility.
另外，你的western band强度不一样啊，in vitro做assay,应当非常一致才对。 |
|
|
m******5
发帖数: 1383 | 33 如题，有一堆priming efficiency 未知的引物，所以觉得 2-ddCT有点误导
可不可以把连internal control 如beta actin在内的 delta CT都列出来？
这种情况下，一个基因是否有显著变化可以 delta CT (目的基因) 对delta CT (
internal control) 作tTEST吧？(这个假定还是目的基因和internal control priming
efficiency一样，但因为CT (internalcontrol)接近零，所以成立 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 34 就是actin filament 汇合的地方，在白细胞里主要由残余的focal adhesion 汇合而成
，细胞一边走一边需要把那些东西给拆了。如果不能成功拆除的话会导致细胞被拉成一
长条。 |
|
b****r
发帖数: 17995 | 35 那不一定啊
actin 这种基因的coding区的序列肯定是进化压力极大，几千万年都不一定变一点，
UTR的话，我们祖先的和我们现在的区别可能就大了。而被转回去的那些copy，那应该
是几千万年来多次发生逆转录的结果，早年转回去的那些UTR区很可能是面目全非的 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 36 qPCR mouse tail tissue extraction DNA
pls refer,
>The SM22aCre-ERT2 mice (Kuhbandner et al. 2000) were generously provided by
Robert
Feil (Interfakulta¨res Institut fu¨rBiochemie,Universita¨tTu¨bingen,
Germany). SM22a protein binds actin and contributes to
smooth muscle contractility ( Je and Sohn 2007; Assinder
et al. 2009) and is expressed specifically in adult smooth
muscle cells of the vasculature and viscera. Genotyping
primers used are listed in supporting information,Table S1.
Genotyping ... 阅读全帖 |
|
|
s*******2
发帖数: 598 | 38 Thanks for all information. |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 39 Co-ask LZ
Is it an inhibitor of mammalian estrogen receptor?
or enhancer of USP-19
If either answer is Bingo,
pls refer
Ogawa M et al. (2011).
17β-estradiol represses myogenic differentiation by increasing ubiquitin-
specific peptidase 19 through estrogen receptor α.
JBC 286(48):41455-65.
HTTP: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21971047
or
Sundaram P et al. (2009).
USP19-deubiquitinating enzyme regulates levels of major myofibrillar
proteins in L6 muscle cells.
Am J Physiol Endocrinol Metab. 297: E1... 阅读全帖 |
|
s*******2
发帖数: 598 | 40 Cisplatin, 12uM concentration for 48 hour, and I treated in H460 cells. |
|
s*******2
发帖数: 598 | 41 1st antibody from SigmaA 5316, 2nd antibody anti mouse IgG from Cell
Signaling #
7076S, all produced in 2012.
Are these 2 antibodies not match well? |
|
A******y
发帖数: 2041 | 42 How do you determine your loading?
But |
|
s*******2
发帖数: 598 | 43 Updated: I tried using Santa Cruz GAPDH(anti-rabbit) as loading control on 1
/24 and 1/25, it is fine. |
|
b**********8
发帖数: 349 | 44 最近发现以前的beta actin内参在某个treatment下变化挺大，于是换用18S rRNA,波动
没那么明显了，但是CT 值只有8点多，查了下资料说18S rRNA 的丰度很高，PCR 反应
中很快就能饱和，大家是怎么解决这个问题的？ |
|
a****n
发帖数: 79 | 45 18S RNA一般只用在northern blotting里做内参吧, RealtimePCR还是actin,GAPDH,
tublin做内参比较常见 |
|
m***o
发帖数: 272 | 46 其实很多文献谈qPCR内参的。可以google一下。这里说一下我的体会。18sRNA 做内参
的一个确定是他不是mRNA,另外他的ct太小。但是有时他还是比较准确。比如我做不同
老鼠的脂肪组织就比较好。而且有片文献专门比较了脂肪组织不同的几个内参，发现
18RNA是最好的一个，而且 在dilute很多的cDNA里，发现变化也不是很大。
不过，我只是在找不到别的mRNA内参时用18sRNA.楼上说用GAPDH，actin，做内参，实
际GAPDH 不是个好的内参，很多时候会变化。我推荐用rpt18.不过再做自己样品时，是
要比较一下不同的内参的。搜搜版上，这个问题好像讨论过。 |
|
S******i
发帖数: 71 | 47 我叫田蓝天，我实名举报我导师刘连鑫和姜洪池2013年发表的HEPATOLOGY 杂志中的文
章涉嫌严重学术造假，这篇文章就是垃圾写手给哈医大又发表的一篇垃圾论文。文章中
所有的数据和图片都是编的，而且证据确凿，我要让所有人都知道这件事情。因为我老
师刘连鑫和姜洪池不让我在哈医大卖文章，这篇文章就是我老师在我手里买的。最明显
的就是文章中数张图片中Actin不是一次做出来，是无规拼凑出来，哈医大的王志国就
是因为这件事情倒下，刘连鑫和姜洪池就是第二个。还有每年哈医大在plos one杂志上
发20多篇文章都是一个写手给写的，不信你看看我们普外科孙备的文章是不是跟刘连鑫
的文章差不多啊，哈哈。还有最傻逼的就是我们医院病理科主任戚继平我卖给她文章没
想到竟然因为图片重复被人举报给撤稿了（主要是因为我找那个写手一时疏忽把图片给
弄串了），而且文章是不是跟刘连鑫和孙备写作风格都一样啊，所有的一切你们看我的
附件就知道了。忘告诉你们一个秘密了就是我对得起你们刘连鑫和姜洪池，因为我卖给
孙备的是4分，虽然他也能发11分的，我是故意的，因为我怕你们俩恨我。我就不说是
谁了，用“手术门”把刘宏宇副院长弄... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 48 今天是周末，对于这个问题我再讲具体一点吧。
一般来说，处理co-localization常用算法有三种
1. PCC (Pearson's correlation coefficient)
2. MCC (Manders' Colocalization Coefficient)以及其优化变种 Costes approach
3. MOC (Mander's Overlapping Co-efficient)
第三种很少有人用，我就不说了。
第一种的好处是可以反映线性关系，对于有直接结合的两个蛋白，原则上这个算法比较
准。如果要对比mutation 和WT直接的结合参数的变化的话，这个原则上是首选。比方
说假如数值从0.2 升高到了0.3，大致就可以认为是一个支持数据来表现结合能力升高
了。但是这个算法有几个坏处：１，对于没有直接关系的蛋白，这个算法非常不准确。
比方说vinculin 和 paxilin,这两者毫无疑问是会colocalize 在focal adhesion 里
，但是用PCC 常常给你算出一个很小的数字。２。数值本身啥都说明不了。比方
说你要是计算F-actin 和v... 阅读全帖 |
|
d****i
发帖数: 2346 | 49 我们使用的是荧光二抗，就是licor的那个，不是HRP，做某蛋白的磷酸化分析，
western。
问题一，一般是先上磷酸化抗体，strip之后再上total抗体，但是这种二抗strip掉信
号很困难，大家有什么好办法？
问题二，western里有磷酸化抗体的信号，total蛋白的信号，还有actin的信号，怎么
计算磷酸化信号的强弱？
谢谢！ |
|
d****u
发帖数: 275 | 50
跑个重复样品，一个P一个T；strip以后其实信号问题也很大；
难道你的total和actin的分子量一样大？
很多软件都可以western定量，如Image J，甚至大家鄙视的Photoshop，推荐用Image
Quant，特别是有大量条带要处理。 |
|
