p*******r
发帖数: 59 | 1 谢谢大家的热情讨论，从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和
cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus.
Welcome more discussions in the future. |
|
z*t
发帖数: 863 | 2 我们用32D细胞做indel，电转，addgene上的P458/459都试过。
电转效率比较低，2-3% GFP+,筛出single cell colony,里面8~9/10都有indel，不过
indel是相当heterogenous,几乎没有一样的。
puro因为电转效率太低，没有长起来。 |
|
x*****e
发帖数: 309 | 3 Try addgene, pLKO
MISSION |
|
i*********0
发帖数: 915 | 4 我都是直接tip到5ml LB medium里面摇过夜。 |
|
j******n
发帖数: 941 | 5 我是用接种环插进去琼脂一下 然后在平板上面分区划线挑单克隆
话说从来没遇到过他家的质粒菌没有说明书的 |
|
E**********y
发帖数: 991 | 6 就用loop挑一点，然后spread在agar plate上就可以了，very easy |
|
C****n
发帖数: 79 | 7 直接tip点一下“穿刺”接的地方，然后stike平板。省时间的话，直接接入Liquid
culture. |
|
s*****g
发帖数: 7857 | 8 我tip 后 液体培养，然后就是 液体稀释从新 铺板挑克隆。然后在大量培养 |
|
l******e
发帖数: 125 | 9 本人菜鸟。想自己设计2个sgRNA KO一个基因，克隆到张峰addgene的lentivirus
system,请教要注意些什么,如何设计？有什么学习网站或资料也给个链接，多谢！！！ |
|
V******t
发帖数: 444 | 10 我刚收到addgene上买来的feng zhang的library
以后基于细胞的screen就是个常规实验了。很多基因很快就要被一网打尽了
要是这些screen都能自动化就好了 可惜没人愿意把生物实验室自动化、标准化啊 |
|
w*********1
发帖数: 27 | 11 之前一直用的四质粒系统包装慢病毒。包括shRNA和普通的DNA表达。但都不是tet
inducible的。最近需要换成Tet inducible的。我想包装系统就不用变了。但需要重新
购买用于包装上shRNA和DNA的tet inducible的表达载体。老板让我去addgene上去搜。
请问各位老师有何推荐的比较好用的载体？谢啦。 |
|
|
K********g
发帖数: 58 | 13 addgene说用直接anneal两个长引物，然后用phusion生成双链
请问高手们给个protocol吧。 |
|
C****n
发帖数: 79 | 14 由于要在不同的物种里试，Addgene的载体对我来说，就是Cas9的序列和gRNA的
tracrRNA部分可以用。我是直接用PCR的，设计了一个很长的引物，直接把20bp的gRNA
加在upstream primer上。 |
|
|
|
b******9
发帖数: 102 | 17 自己动手啊，又不是很难，addgene有现成的质粒，买来直接用，只要自己构个donor就
行了。 |
|
|
|
j********r
发帖数: 156 | 20 which CRISPR vector(S) have you used to introduce single AA mutation? There
are tons of vectors on Addgene, such as all-in-one vs cas9 and sgRNA in
separate vectors, regular or viral vectors. Any comments or protocol will be
highly appreciated! |
|
x*****e
发帖数: 309 | 21 其实是TRC(Then RNAi Consortium)的东西放在Sigma了，http://www.broadinstitute.org/rnai/public/。 我一般google: "shRNA+gene name+TRC" 能找到别人文章验证过的shRNA， 在到前面提到网站根据TRC ID找到需要合成的引物序列，根据addgene pLKO cloning protocol很快就做好了。当然能从Sigma买到细菌更方便了． |
|
|
v**********m
发帖数: 5516 | 23 它只是一个非盈利的交换中心，他们只是收取管理费，质量靠用户自律。如果要查实验
数据，保证每个上传者确实递交正确的材料，用户掏的费用增加十倍都不止。 |
|
s*****i
发帖数: 315 | 24 测序也只是测一小段
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
|
D******a
发帖数: 39 | 25 No, they sequence the whole plasmid |
|
|
s*****g
发帖数: 7857 | 27 支持review
我也买过他们的东西。感觉不太好。后来就买公司的东西
~50刀（一个plasmid）和800多刀(4-5 plasmids)的区别（shRNA Plasmid） |
|
l***y
发帖数: 638 | 28 买到烂质粒的都打电话跟他家客服complain
找大牛老板去要求
等有闲工夫的兄弟造个网站专门让大家去写他家质粒reivew |
|
s******y
发帖数: 28562 | 29 有闲工夫的兄弟造个网站专门让大家去写他家质粒reivew
我觉得这个是最有效的方法。另外，大家开会的时候碰到他们公司的人就一致向他们抱
怨好了。过几个星期我去参加AACR,碰到他们公司的人我一定去炮轰一通。 |
|
n********e
发帖数: 50 | 30 多谢sunnyday。大家都知道那种用到劣质试剂的心情 － 花了钱尤其是精力与时间，结
果是问题处在试剂而非实验上面。 |
|
E*********4
发帖数: 16 | 31 我把一个蛋白的基因插在本来是shRNA的位点（AgeI site），做了transient
overexpression，可以做puromycin筛选，检测到蛋白表达，但是做了virus之后，加
puromycin，细胞全死了，说明puromycin没有表达。这是为什么呢？BTW，在我的基因
前加或者不加promoter，会有什么影响吗？
这是Tet-pLKO-puro的链接：
https://www.addgene.org/21915/
非常感谢！ |
|
j******i
发帖数: 939 | 32 我觉得，Feng更在意诺贝尔奖吧。他现在所有的plasmid都第一时间寄存到Addgene, 大
大促进了这个领域的进步（大概是为了拼人品 ：）尽管他是不是第一个发明有争议，
他对这个领域的推广的贡献最大毫无争议。 |
|
|
|
|
s*******1
发帖数: 188 | 36 addgene上买了zhang feng实验室的lentiCRISPR V2质粒，然后老板从文献上找了两个
sgRNA，克隆进去，做病毒，转染细胞，这些都是常规实验，没有任何问题。
然后老板让我测序看看是否对目的基因的编码序列产生影响。
由于是新手，看的文献也不多，请问大侠们，怎么能够测序分析出sRNA对目的基因的编
码序列的改变呢？
谢谢 |
|
|
|
|
|
B***v
发帖数: 113 | 41 出idea不等于让你做，能不能做还得“导师”说了算
好的idea“导师”很多时候看不到其中的亮点
换来换去终于有个idea让你做了，实验室也未必有足够的条件做（设备，动物模型，放
射性元素使用）。
就算让你做了，遇到困难也别指望“导师”能提供啥建设性意见
“导师”往往在学术圈没人知道。
和学术圈很难建立合作。
连买个AddGene的质粒都没可能。
出高影响因子文章很难。
楼上说的对，进工业界得拼软实力。 |
|
z*t
发帖数: 863 | 42 哈哈addgene这个吐得一手好槽
industry干个啥都得license也是醉了。。。
其实进industry后 即想学术自由又想赚钱几乎不可兼得
能达到这个层次的即使在Genentech&Novatis也并不多
G的Vishva拿industry钱发学术文章的人更是少之又少 |
|
w**********k
发帖数: 386 | 43 addgene的确比较坑，去了Industry后你的career就是升职，赚钱，不可能有学术自由
。在美国这个社会，用自己的学识赚钱是个不错的事情啊。
说道学术自由，即使在学术界只有established 科学家才可以做到。大部分小PI也只是
为了向NIH讨食度日，其实还是个钱的事儿。 |
|
k********n
发帖数: 756 | 44 想做个质粒用CAG promoter在NEURON里面表达，Addgene有个现成的但是CMV promoter
with CAG enhancer. 它的效果和CAG promoter在神经元里表达会是一样的么？ |
|
z*t
发帖数: 863 | 45 无论怎么吵，峰哥在推动crispr在research community的分享上居功至伟。你看看
addgene有多少他的plasimid，有多少同志直接受益。要是他真猥琐的话现在你我用的
crispr可不是这么便宜了 |
|
z*t
发帖数: 863 | 46 钱永建之前的对荧光蛋白的拓展应该能排的上，某种程度上钱永健在荧光蛋白和张峰在
CRISPR的贡献很相似
不过当年没有addgene这么发达的系统哈哈 |
|
w*****t
发帖数: 179 | 47 说句实在话，我还是很支持张锋的，我个人觉得，谁对这个领域的推动大，我就会支持
谁。我本人是用了很多张锋在ADDGENE的质粒，包括跟他直接发信都会回，关于专利我
不是很清楚，但是随后的工作还是张锋做的最好。有一点希望就是张锋申请到专利后不
要影响纯学术的研究。
Charpentier |
|
w*****t
发帖数: 179 | 48 说句实在话，我还是很支持张锋的，我个人觉得，谁对这个领域的推动大，我就会支持
谁。我本人是用了很多张锋在ADDGENE的质粒，包括跟他直接发信都会回，关于专利我
不是很清楚，但是随后的工作还是张锋做的最好。有一点希望就是张锋申请到专利后不
要影响纯学术的研究。
Charpentier |
|
z*t
发帖数: 863 | 49 无论怎么吵，峰哥在推动crispr在research community的分享上居功至伟。你看看
addgene有多少他的plasimid，有多少同志直接受益。要是他真猥琐的话现在你我用的
crispr可不是这么便宜了 |
|
z*t
发帖数: 863 | 50 钱永建之前的对荧光蛋白的拓展应该能排的上，某种程度上钱永健在荧光蛋白和张峰在
CRISPR的贡献很相似
不过当年没有addgene这么发达的系统哈哈 |
|
