x**y
发帖数: 46 | 1 跟我最近的EMSA相似，给你一些有用的意见：
1. 如果你的蛋白有aggregation，加一些Triton100(0.1，0.5or1%). 听很多人说，这
很有用。
2. 用4-12% TBE gel （Invitrogen）。如果自己配，用4%。或者3%，下层加三分之一
15%防止free probe run out。
3. 如果还不行，用垂直配胶系统（Bio-rad配PAGE gel用的， 1.5mM）配Agrose胶（1%
？ 2%？记不清了）。里面可以加Triton & glycerol。
我的蛋白80kD， oligomerization 后500 or 1000kD （FPLC测定）。6%TBE gel完全在
well上，4-12%能进一点点，3%可完全进入但很难看。最近我们lab新来的Postdoc用了
Agrose胶，效果不错。我让他加了一些Triton & glycerol，效果更好了，binding
affinity 都增加了几倍。但具体浓度，我得问问他。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 2 最近在做一个转录因子的 ChIP, 用的是 Richard Young 的protocol, 可是 IgG IP 的
在有的sample总是有很强的信号，当然也有的 sample IgG pull down 下来的很弱的。
我想请教一下如何降低这种non/specific binding, 我用的是 invitrogen dynabead。
以前用过 millipore agrose bead ,记得 agrose bead 要用 salmon sperm DNA block
的，我想请问一下有没有人用salmon sperm DNA block dynabead。 问过 invitrogen
technical support，他们不推荐，但是也说不出个理由，只是没有人这么做过而已。
如果有人试过不行，那我也就不必试了。多谢 |
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p*********3
发帖数: 8525 | 3 钱老轮回来讲讲，谁对谁错
方舟子老师：您好。
针对您昨天的文章，韩春雨回应了一些所谓的实验细节，见
http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93
027569268，想必您也看到了。
他公布的所谓“高超的实验技巧”，包含三点：一是质疑者的细胞都污染了；
二是要做银染；三是要做GFP敲入（knock－in，KI）实验证明NgAgo可以work。
回应如下：
一，保证实验室的细胞没有支原体污染，不是什么高超的实验技巧，而是一
个正常实验室最基本的操作规范，比如每三个月定期检测支原体污染。
二，银染并不是什么高深的实验，而是使用了几十年的常规技术，按照
protocol配好buffer，把胶扔进去染色，没有人不会做。银染非常灵敏，反应速
度很快，容易出现信号饱和，不适合定量，容易产生假阳性条带。韩春雨的
Nature Biotechnology文章里面测试了50个位点切割基因组，每个都work，无一
例外，效率最低的也有15%（补充数据图5），高的有30%（图4）。这样的效率要
银染才能看到？普通... 阅读全帖 |
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z*****6
发帖数: 1486 | 4 还有没有味道的gelatin? 如果没有太多其他添加剂，那肯定算是好食材了。我还以为
果冻都是agrose呢。 |
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z*h
发帖数: 773 | 5 I just did it 1.5 month ago.
Let me explain my ways,
For double disgested vector, using agrose to separate the DNA fragment and
using QIAGEN gel kit to get it.
For mutated DNA fragment, you should design the primer containing restriction
enzyme cutting size plus several NT to ensure the resricting enzymes can work
efficiently. Check this information from Appendiex of NEB catalogue.After
digestion, using DNA concentrator kit to remove enzyme, salt and small end of
DNA fragment.
Mix your vector pl |
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D******9
发帖数: 2665 | 6 test different condictions, run them on agrose gel |
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c*****e
发帖数: 619 | 7 glassmilk 对于genomicDNA也好使用吗？如果可以，protocol怎么弄呀？
好像Glassmilk是用于纯化DNA来自agrose gel的吧。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 8 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
品之间加的量就有点不同了啊。
2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
这样最后打算把IP产物如果一半做
wb，一半做银染，岂不是分不准了。
4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
会降解的自然不需要加”。现在开始加
PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 在agrose胶上，RNA product看起来多大？
我在胶上跑出来都是和我的DNA templete同样大小的东西，几乎重合在一起，似乎不大
make sense? |
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m*****n
发帖数: 760 | 10 for fast examination, you could run your RNA samples on 2% TBE agrose gel.
for accurancy, you want to run them on denaturing PAGE gel. |
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s*********t
发帖数: 600 | 12 protocol一搜一大把呀 找篇大文章method部分 自己修改下就能用
M2 resin有几个常见的contamination
最好有个control对照一下
用agrose beads preclear一下也行 不过不是必须的
盐浓度和detergent也比较重要 |
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b****r
发帖数: 17995 | 13 100多bp的片段差14bp，普通agrose做硬一点跑慢一点冷一点毫无压力 |
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t**l
发帖数: 109 | 14 现在实验室还是用那种小刀片，每次都要把手伸到UV light里面才可以，有没有那种可
以有把手的刀，可以远距离操作，或者可以把一次性的刀片组装上面的那种工具。多谢
。因为预计要做大量的gel extraction. 不想伤到自己。大家切gel的时候都怎么做的 |
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m*****1
发帖数: 5879 | 15 年底毕业，求职中，请有工作机会的推荐，谢谢。
经验：
Instrument operation and maintenance: Varian GC-MS, Shimadzu GC, Beckman
HPLC, Agilent HPLC,
Thermo LTQ, Thermo TSQ vantage. Thermo nLC-NSI-LC/MS/MS,
Separation: Nano and μ-LC, HPLC, PAGE, Agrose gel
Detection: mass spectrometry, UV spectroscopy.
Biological technique: Cell Culture, RT-PCR, siRNA-knockdown, Plasmid
Amplification and
Transformation, RNA and DNA extraction from cells and tissue, SDS-PAGE
paper 有一篇10分的一作，若干5分左右的非一作。
希望找公司的工作，暂时不考虑博后位置，谢谢。请站内。 |
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m*****1
发帖数: 5879 | 16 经验：
Instrument operation and maintenance: Varian GC-MS, Shimadzu GC, Beckman
HPLC, Agilent HPLC,
Thermo LTQ, Thermo TSQ vantage. Thermo nLC-NSI-LC/MS/MS,
Separation: Nano and μ-LC, HPLC, PAGE, Agrose gel
Detection: mass spectrometry, UV spectroscopy.
Biological technique: Cell Culture, RT-PCR, siRNA-knockdown, Plasmid
Amplification and
Transformation, RNA and DNA extraction from cells and tissue, SDS-PAGE
paper 有一篇JACS的一作，一篇10几分的二作，若干5分左右的非一作。
求工作。站内或者回帖留下联系方式。 谢谢。 |
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