x*****9
发帖数: 68 | 1 1）biotin label protein 经过trypsin digestion过avidin bead， 不知道原来溶液
里面的urea会不会干扰biotin和avidin的binding
2）看到cravatt的文章， on-bead trypsin digestion， 问题是trypsin不会把bead
上面的avidin也digest么？
谢谢 |
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x*****9
发帖数: 68 | 2 1）biotin label protein 经过trypsin digestion过avidin bead， 不知道原来溶液
里面的urea会不会干扰biotin和avidin的binding
2）看到cravatt的文章， on-bead trypsin digestion， 问题是trypsin不会把bead
上面的avidin也digest么？
谢谢 |
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m*******n
发帖数: 1214 | 3 1/ you have to dilute down your urea
2/ avidin beads is not that easy for trypsin to digest.it is on solid beads,
even a little was digested, so what? the Mass can still detect them as long
as your sample don't containing avidin, so it is kinda irrelevent |
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h****6
发帖数: 229 | 4 I used reversible avidin column for in vivo biotin labeled protein
purification. Elution was done with biotin. Worked pretty well. Forgot which
brand. Maybe Promega. |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 avidin-containing target + biotinylated probe + avidin-containing Ab,
看到了signal。可是只记得一个avidin能bind 几个biotin。莫非avidin
multimer会dissociate，and then interact w/ exogenous avidin? |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 Avidin和Streptavidin都是Tetrameric，可以bind多至4个biotin分子。没听说过一个
biotin分子会bind多个Avidin的。
不过我不太明白你的描述，可能是我没理解透你的实验设计。你的Ab是Anti-target的
还是Anti probe的啊？还有就是你的target是Avidin containing，probe是
biotinylated，那你怎么知道Target-probe的binding是发生在Avidin-biotin之间还是
target-probe之间啊？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 被拆穿了-_-我其实是偷懒，assume biotin只能跟一个avidin bind，所以assume
有signal的话应该是probe跟target bind，biotin跟avidin-ab bind。但是
结果发现negative control（有avidin没target）也有很强的signal。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 Avidin是鸡蛋清里提取的，是碱性的。
Streptavidin是链霉菌里提取的，是弱酸性的。
Neutravidin是化学修饰过的Avidin，是接近中性的。
Streptavidin和Neutravidin的优点就是non-specific binding比Avidin少。
不过你既然用的就是Streptavidin，那我就不清楚了。但是你的probe还是有可能跟
Streptavidin有cross-reactivity的。你screen probe之前用Streptavidin做过
negative selection了么？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 9 很难啊，Avidin也是蛋白，影响到其他蛋白的detergent一样会影响avidin的。
不过说实话，没太看懂你要做什么，我今天会开多了，理解力严重受影响。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 10 最简单的biotinylated oligo往avidin NP上conjugate，yield巨低。。。
请教biotin-avidin interaction 会很挑buffer/etc condition吗？ |
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s******s
发帖数: 795 | 11 想研究protein A与B/C/D等的相互作用。
因为没法（或者很难）把蛋白A偶联到sepharose beads上，但是有commercially
available biotinylated protein A可以直接买（sepharose conjugated with
streptavidin当然也有卖），所以计划通过streptavidin+biotin搭桥，间接把protein
A
结合到sepharose beads上（sepharose-streptavidin + biotin-protein A），然后装
填柱子，然后apply protein B/C/D。
从来没做过avidin+biotin相关的实验，请问有朋友做过类似的么？streptavidin+
biotin的结合够强壮么？
假设 protein C可以与protein A结合，最后形成sepharose-streptavidin + biotin-
protein A + protein C。在wash和elute的时候，有特定的或者通用的条件可以
1。wash掉非特异结合的其他protein
2。特... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 要把target protein conjugate到beads上用于下游的separation。现在在试
dynabeads，发现conjugation efficiency远低于预期值。而且比较头疼的是
要测出真实efficiency也很tricky。间接测反应后溶液里剩多少protein很
不准。
请高手指教有没有efficiency比较高的beads？最好是magnetic的（是不是
只有dynabeads系列？？），其他的介质也可以。最好是covalent linkage，
biotin-avidin的也行。BTW我的target protein pI在5~6
非常感谢。 |
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e**s
发帖数: 856 | 15 多谢。
我是买了promega的1ml的柱料。由于表达量低，再加上用的pinpoint的in vivo
biotinylation，效率也不是很高，据说损失会很多，请教有经验的朋友，不甚感激！
！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 就是pierce的那个。想请教一下通常的yield有多高？第一次pilot，biotinylate后
跟streptavidin beads incubate，然后测bead上protein跟original input比，
只有10％，比预想低很多。biotin-avidin interaction应该不可能差。想到的只有
biotinylation本身出了问题。
多谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 Avidin是basic protein，有可能和你的probe(我suppose是DNA aptamer?)有非特异性
的结合。你用Streptavidin或者Neutravidin试试看。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 18 我用的就是streptavidin。话说一直没搞清avidin/streptavidin/neutravidin的
区别。。。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 打算用biotinylated的RNA probe做一些检测蛋白、核酸相互作用的实验， 加热revers
e crosslink以后
需要用beads把这些RNA probe和直接相互作用的核酸除掉，但是不想碰那些pull-down下
来的蛋白和其他核酸。
Anyway, 简单说，就是用什么浓度的什么detergent可以解决掉蛋白/蛋白和蛋白/核酸的
interaction,
但是不影响核酸/核酸以及biotin/avidin的interaction？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 20 我用的是pH 7.4的20mM Tris Acetate buffer，还含了140mM的NaCl和5mM KCl, 1mM
CaCl2, 1mM MgCl2
这个recipe应该是从这篇paper来的：Bock et al. Nature 1992. (355)564-6. 这篇
paper不是用biotin-streptavidin interaction，但是我们就用这个条件做好像没啥太
大问题，至少bind得貌似挺好。
你有没有做个positive control看看是不是你的nanoparticle或者labeled oligo本身
的问题啊？biotin-avidin的binding应该是不太挑条件的，要不然就不会应用那么广了
。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 21 by other methods you mean other than biotin-avidin? I chose this
as I thought it's the easiest...
I didn't know that... do you know the reason ? thx! |
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w******e
发帖数: 1187 | 22 要求本身MW小，能与某protein有很强affinity（类似biotin-avidin），
最好很常用，可以买到各种conjugate form。除了biotin还有什么
好的候选？多谢！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 24 多谢！我想要的是biotin-avidin之外的interaction，因为我要做sandwich
assay，capturing agent用了biotin了，detection agent要换个别的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 应该有这样的技术吧，就是表达某个跨膜biotin蛋白，然后用beads
纯化这样的细胞。有没有什么paper做这个的，或者名字我可以google的
多谢了 |
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d****u
发帖数: 275 | 27 Surface/membrane protein extraction kit
1)Incubate cells with biotin
2)IP with Avidin
3)Detect your protein of interests.eg WB
Good luck. |
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H****s
发帖数: 301 | 28 我来抛砖引玉吧：
（1）streptavidin+biotin的结合够强壮么？
够！非常够。
（2）在wash和elute的时候，有特定的或者通用的条件可以用吗？
这取决于A和C的结合强度，所以，怎么洗，怎么洗脱需要摸条件。
（3）请问有商用的sepharose-streptavidin推荐么（或者其他avidin variants
conjugated to agarose or sepharose beads）？
你可以试试Miltenyi的streptavidin microbeads或者其它品牌的，非常多。这个技术
比较成熟，基本的protocol可以在文献中很容易找到。
最后，需要考虑的是：你怎么保证商用的biotinylated protein A仍然具有protein A
的生物学活性？或者说biotinylation不会影响到A/B/C/D的结合？
protein |
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s*****1
发帖数: 273 | 29 This is my collection over the last two years. Hope it will be of some help
to other test-takers.
gastrogastrostomy 胃胃吻合术;
genioglossus 颏舌肌;
glyceryl guaiacolate 愈创木酚甘油醚;
glycyl glycine N-甘氨酰甘氨酸
Threonine 苏氨酸［氨基酸类药］
Propionyl-CoA carboxylase 丙酰基-CoA羧化酶;丙酰辅酶A羧化酶
ophthalmoplegia n.眼肌麻痹,眼肌瘫痪;以眼的运动神经麻痹为特征的疾病;此病往往
发生于重症肌无力、肉毒中毒、维生素B1缺乏和颅内神经疾病.
Ketoglutarate 酮戊二酸
Wernicke center 韦尼克中枢(言语中枢〕
gluconeogenesis 糖原异生[作用];糖异生
Pyruvate 丙酮酸盐;丙酮酸
carboxylase 羧化酶
Acetyl 乙酰
avidin 阿维丁;抗生物素蛋白;卵白素;亲和素〔分〕
Alopecia |
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