s*********y
发帖数: 579 | 1 正在backcrossing一个基因敲除的小鼠，ES细胞是B6/129。
backcross到B6，才3个generation，和B6的相识度已经98%了，这是Dartmouse公司的
SNP给的结果。为什么会这么快？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 2 因为他们筛SNP吧。
从第二代开始因为有crossing over，不是绝对的75%而是有的多于75有的少于75，他们
就全基因组筛一遍选最高的来backcross |
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s*********y
发帖数: 579 | 3 我前面三代backcross都没用他们公司的SNP，都是我随便挑几个做的。为了加快速度，
才开始用了他们的服务。 |
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g***j
发帖数: 40861 | 4 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: gshjj (各输己键), 信区: Biology
标 题: Tough Lessons From Golden Rice 不错的转基因故事
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 2 22:51:41 2011, 美东)
Tough Lessons From Golden Rice
Martin Enserink
It was supposed to prevent blindness and death from vitamin A deficiency
in millions of children. But almost a decade after its invention, golden
rice is still stuck in the lab
It's easy to recognize Ingo Potrykus at the train station in Basel,
Switzerland. Quietly waiting while hurried travelers zip ... 阅读全帖 |
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g***j
发帖数: 40861 | 5 Tough Lessons From Golden Rice
Martin Enserink
It was supposed to prevent blindness and death from vitamin A deficiency
in millions of children. But almost a decade after its invention, golden
rice is still stuck in the lab
It's easy to recognize Ingo Potrykus at the train station in Basel,
Switzerland. Quietly waiting while hurried travelers zip by, he is holding,
as he promised, the framed and slightly yellowed cover of the 31 July 2000
issue of Time magazine. It features Potrykus's bearde... 阅读全帖 |
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s********d
发帖数: 156 | 6 谢谢楼上各位。
老鼠是129 strain, BACKCROSSed TO c57bl/6 for 6-7 generations. we have the
problem I mentioned from the 5th generation.
如果要BACKCROSS, 应该是KO 还是 HET， male or female? 我以前一直用HET的。 因
为觉得WT 不太正常了，是不是用KO和C57 BREED 一次要好些？
还有，很多实验室做HFD什么的，需要很多老鼠，应该是KOXKO 和WTX WT来获得的吧，
要是都从HET X HET来，那需要很大工作量啊，虽然HET X HET 拿到WT/KO是最合理的。
。还有，如果想要达到大量HET，可以用KO 和WT 来获得吧，那KO最好用MALE 还是
FAMALE?
不好意思，TYPING 太乱。希望表达清了。老鼠快要让我抑郁了。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 7 一种可能是KO的phenotype对后代有影响。很多phenotype都是互相联系的，你不知道ko
怎么就影响了后代表型了。
一种可能是这个基因在129和b6上的penetrance不一样。这个无数ref证明无数的gene都
有这个现象。
BACKCROSS无所谓het或者ko吧，反正f1之后就全是het了，要不怎么叫BACKCROSS？
最好的方案是het x het，这样你测的才是littermates的数据。如果图省事用ko x ko
，现在做老鼠的reviewer肯定会要解释。一般都是说因为het x het不可行，因为小老
鼠不吃奶啊，或者double or triple KO，做het x het工作量大的没边儿了，什么的，
才不得已用ko x ko |
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s********d
发帖数: 156 | 8 谢谢楼上各位.大家得建议我会都试 一下.
至于为什么BACKCROSS到C57,我也不清楚,我接手的时候已经这样了..第一篇文章发的时
候BACKCROSS到也就5代..我估计老板那时候抢着想早发出去,反正PHENOTYPE很明显也很
好,所以文章也发了很高杂志. 我接过来想深入做下去,就遇到了一系列的问题. 我
们主要做生化的实验室,我个人觉得做动物试验确实不是很严谨规范. 还有我说工作量
大,是因为弄动物只是我工作的一小部分,因为没数据出来啊,还有其他PROJECTS要做的.
有时候HETXHET 好几组都搞不到几只KO做试验,给老板啊别人啊看起来就是你没有工
作量一样...我知道好多实验室都是专门有人管老鼠的.. |
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y**********g
发帖数: 2285 | 9 靠谱吗？
LONDON: Humans are actually hybrids, who emerged as an offspring of a male
pig and a female chimpanzee, according to one of the world's leading
geneticist.
Turning the theory of human ancestry on its head, Dr Eugene McCarthy — one
of the world's leading authorities on hybridization in animals from the
University of Georgia has suggested that humans didn't evolve from just apes
but was a backcross hybrid of a chimpanzee and pigs.
His hypothesis is based on the fact that though humans have ma... 阅读全帖 |
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i**b
发帖数: 3 | 10 这几天除了藏毒，估计最沮丧的就是汉奸们了。本来趾高气扬的，以为中国政府多么不
得人心，中国新一代们是多么的仇恨中国政府，还以为有那么多人和他们在一条船上。
可是事与愿违，这次火炬接力事件充分显示了全世界华人的爱国热情，可以说是火炬走
到哪里，哪里就是一片红色的海洋。特别令人欣慰的是那些80后甚至90后的学生们，用
自己的行动来维护祖国的尊严。汉奸及其主子们本来还把希望寄托在这些年轻人身上，
现在也应该清醒了。
不过汉奸们不要绝望，刚才不是有人列出了一个汉奸列表马，粗略一看有几十人之众。
你们应该联合起来，加上其他北美论坛的汉奸们，估计因该不下几百人把。然后你们向
美国政府申请，划一块地把你们圈养起来，并提供经费上的资助。然后你们几百号人就
拼命在这圈里OOXX，拼命造人，毕竟仅靠几百号人无法完成推翻中国政府，分裂中国的
大计。考虑到这几百号人可能男女比例失调，为了不耽误时间，下一代也可以和上一代
XXOO，生物学上叫做BACKCROSS，争取在最短的时间内造出最多的小汉奸。
CIA给你们的钱就用来买武器，都买最先进的，武装到牙齿。考虑到现在美国江河日下
，你们主子们的腰包也越来越紧。你 |
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w*****n
发帖数: 107 | 11 我遇到过和你类似的情况，不过是我找别人要老鼠。对方给了，但是要authorship, 我
觉得reasonable.
"thanks very much for your note. We would be happy to send you the mice,
which have been thoroughly backcrossed on a C57Bl6 background. As you may
remember from the paper, they get pretty sick and don't breed as homozygotes
. An alternative might be the floxed allele, which we also have, and you
are welcome to. In general, we ask to be offered co-authorship on papers
using the mice, which I hope is not too onerous." |
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D*a
发帖数: 6830 | 12 你这种情况是+/0， +/-是非常错误的写法。
没必要测背景情况，你测一堆snp又能说明什么？你又不是要写哪个snp跟哪个
phenotype有关系。20只不少了，没有phenotype就是没有phenotype了，不会是背景的
问题。就算是背景的问题你也不能把一顿有tendency的数据都归结到背景上，基本上就
可以换project了。否则只要significant，就算reviewer非要说背景问题，你也可以回
答得了。
我知道很多做转基因的想要换背景，也是backcross两到三代就开始实验的，之后重复
重复看看吧，没有人等到20代才正式开始做实验的。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 13 那要查很多吧，工作量很大的。好几百个pcr才能看完一个chromatin好像。花钱肯定会
有人做的，就跟那个快速backcross（号称几代之内得到99% background的某种tg老鼠
）一个原理。
你做开头了，每个实验都要做。
那么就算你做了，你要怎么用这个数据？依据这个把不符合结果的老鼠删掉？或者跟
reviewer说我们这个结果是用treatment解释的，这个结果是用background解释的？
我觉得你的phenotype既然是跟background有关，就不如使劲用一种老鼠当爹（或者妈
），等你实验做到差不多考虑发表的程度，你的纯化background也差不多了。大不了重
复几个开头的实验。
否则你拿F2混交F3，然后F4，然后F5.。。。这样时间长了你的background就固定下来
了。万一你恰好丢了影响你phenotype的那段genome，你就哭吧。。。 |
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s********d
发帖数: 156 | 14 养老鼠经验不多。
接过来实验室的一个KO STRAIN,养着发现问题很多，郁闷。。首先，为了多拿KO和WT做
试验，我们设的是KOXKO, WTXWT,前几代还可以，后来KOXKO不怎么生，或者生下来就死
。 只好做HETXHET，结果还是KO很少，和WT,HET不成比例。 其中有几笼一直是~HET
X HET MATING,最近发现 生下来的WT HET 长的不大正常了，MALE WT到3个月大时候
就有～40g 体重，FAT 很多，明显有OBESITY的倾向。不是全部，有一些还看上去正常
。。试验结果组内差异很大，很难归纳结论。。请教一下，这种情况是怎么引起的，怎
么解决啊。 我在想用KO 或者HET跟C57 `backcross 一下，重新得到HET，有没有帮助
。。
养老鼠真是贵，我看一些资料都说最好不要用KO X KO, 应该是 HET X HET 生出来的
KO 和 WT 用来做试验。可是如果需要几十只大量呢，都要GENOTYPING 太麻烦了吧。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 15 1 要时常backcross一下
2 几十只还算大量啊。。。 |
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s********d
发帖数: 156 | 16 是不是C57有易胖的倾向啊。好像哪里看到过。这样是不是可以解释我BACKCROSS越多以
后WT 和HET都比刚开始的几代胖？ 否则HET X HET出来的WT 和HET 变胖和我敲掉的
GENE 有什么关系？ 实验室刚开始做另一个KO老鼠，得到的CHIMERA怎么看怎么觉得很
胖，WT 也是，它的BACKGROUND就是C57. 所以楼上讲的可能有道理。。那目前我应该
怎样BREED更合理或者能多少降低不同STRAIN造成的差异呢。 |
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y****i
发帖数: 2194 | 17 你必须先backcross到纯background了（10代左右）
然后必须用HETxHET
不然你什么肥胖以及HFD的结果完全都不能用 |
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s********d
发帖数: 156 | 18 前面POSTDOC的结果我相信,因为PHENOTYPE确实还比较稳定.我觉得问题就出在她只做
BACKCROSS了5代,可能都不到. 她那时好像也没有KO X KO 存活低的问题.也没有我讲的
WT 不正常的问题. 但记录看来她的结果很多不是从HET X HET来的,而是WT X WT, KO
XKO 或者KO X HET.因为交接的时候很多BREEDER都是这样的,虽然也都是SIBLING. |
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O******e
发帖数: 4845 | 19 首先要关心的是为什么死－－如果还没有人做过相关研究的话。
毛发这东西，关心的人少。你让你朋友先backcross几代看看这个hairless phenotype
能不能维持再说吧
道。 |
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g***y
发帖数: 201 | 20 取决于你们做KO用的embryonic stem cell 是从那个strain里面提的。
传统上很多都是用129，129 coat color 就是agouti
如果是从129来的，cross with b6,
F2 就会出现segregating coat colors.
如果想得到品系纯的老鼠, 或者把现在的不纯的backcross，或者把最初的chimera，直
接breed 到
跟ES cell 背景一致的129 substrain |
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D*a
发帖数: 6830 | 21 你要是觉得不纯就backcross，没必要看它是怎么不纯的，浪费时间。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 22 129太复杂, 我觉得backcross to B6比较好. 如果phenotype跟strain有关就会有麻烦. |
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i*********0
发帖数: 915 | 23 normally we inject several clones and then backcross to b6 and wait and
confirm with southern or PCR. |
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f*******e
发帖数: 354 | 24 方法 2+6 失败
2+2+2+2 失败
MDI 失败
MDI+troglitazone 失败
MDI+troglitazone+BMP4 失败
MEF C57 （backcrossed 10g+）
同时的KO MEF 分化的很凶猛
到底是什么问题，头大，有没有人遇到过类似的情况
WT/Het(6+3)共九株原代 都不行
KO 每株都行
aaaa，谁来救救我！！！ |
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g****0
发帖数: 425 | 25 Yes, but case by case. It is always a good idea to backcross to pure
background. |
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s******y
发帖数: 220 | 26 我的摊子已经铺的挺大了，三天两头就是一大窝小鼠。
因为我有三个转基因，所以得到我要的纯种几率很小，
所以我希望拿到纯种配纯种，后面都是纯的了。
然后就有相关control的问题了，
如果我拿到了纯种，然后和平行的het breeder里面得到的wt 和相关control比，
这样OK吗？
btw，我没有backcross他们， 背景比较杂：（ |
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n***3
发帖数: 663 | 27 最近读很多的paper都涉及到自己做knockout 老鼠，其中好多是用 129sv老鼠做的
knockout, 然后再 backcross with Black 6 (B6) 老鼠至少五代以上，然后比较
wildtype 和knockout在某些代谢途径中的差异。他们实验中的wild-type老鼠用的是
knockout的littermates, 好想不是直接用B6老鼠。谁给说一下到底能不能直接用B6老
鼠呢？ |
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a***3
发帖数: 45 | 28 但现在的趋势是用B6ES细胞，可以节约很多backcrossing 的时间。因为很多实验要求
纯的B6背景 |
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D*******8
发帖数: 4 | 29 Please don’t dig me out. I am writing this out of my conscience as a
scientist. We are using, largely, the tax payers’ money to explore
mechanisms underlying diseases that we don’t have a cure, yet. We are doing
this in the hope that little bit knowledge can accumulate till one day we
can find that magic bullet. However, there are people out there, their
purpose is to use these money to achieve their personal fames, sometimes
international ones, totally disregarding our original noble cause. I... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 30 那你不是应该送很多老鼠尾巴去再根据结果选用哪只么，怎么只有一个数据？ |
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s*********y
发帖数: 579 | 31 刚开始图省钱，都是我自己随便挑两个交配的。
后来为了赶进度，就寄了几个老鼠尾巴，结果发现都是超过95%的B6 background了，我
估计应该只有85%左右的。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 32 运气太好？要么就是他们SNP不准。
我们这里听各种大小讲座这个技术听了好几遍，但是都不认识谁真用了这个技术。
不知道测一遍贵不贵，要不你寄个F1的尾巴去测测看是不是50%、、、 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 好运道LZ
争取发个Cell 一作啥的
进Ivy Leage Medical School 当AP/PI
超过sunnyday |
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D*a
发帖数: 6830 | 35 要不你自己选几个SNP或者PCR的loci做做看看结果是不是一致吧。。。
100bp左右如果差个10bp左右，PCR还是可以分出来，4%的agarose胶。
jax网上marker很全，但是strain不全/长度不准，得自己订了primer来跑跑看。 |
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s*********y
发帖数: 579 | 36 多谢DUA，我准备再cross一代，然后看看什么情况。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 37 Materials and Methods
Mice
FVB/N mice carrying the human DTR transgene under control of the CD11c and
CD11b promoters obtained from Dr. R. Lang (Divisions of Ophthalmology and
Molecular and Developmental Biology, Children’s Hospital, Cincinnati, OH)
were backcrossed onto NOD/LtJ mice (origi- nally purchased from The Jackson
Laboratory) for 10–12 generations to produce CD11c-DTR/NOD and CD11b-DTR/
NOD mice;
DTR transgenes were identified by PCR on tail DNA using primer se- quences
for DTR-1 (5'-A... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 220 | 38 我的project是杂交了两个line的老鼠，一个是心脏病模型，另一个是特定磷酸化位点
被disable的老鼠（S-A mutation）。因为disease model本来就是个不纯的遗传背景，
然后我又不怎么懂这些老鼠遗传，所以老鼠们一直都有mixed genetic background的问
题。
文献里关于这个磷酸位点的作用本来就很大争议，有人说这个mutation能帮助救助心脏
病，有人说没用。现在我们发现，治病是不太可能了，相反，在这个位点是
heterozygous的时候，这个病更严重了，所谓的heterogeneous disadvantage。因为我
们这个研究的蛋白是个tetramer，所以我们搞出一个hypothesis来解释这个现象，我还
在做一些实验来验证我们的理论。
请问我们观察到的这个现象是由于遗传背景不纯的可能性有多大呢？我的control都是
litter match的啊，所以虽然是个mixed background，但是是可比的。 我觉得现象应
该是真实存在的。
但是现在我在写proposal，虽然我有个hypothesis来解释这个现象，也有一个些... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 39 写proposal没大有关系吧？发文章的话reviewer不大好搞。所以为了应付将来的问题还
是最好平行建立一个backcross，最后或者你自己主动稍微重复几个实验，或者等到他
们挑刺的时候可以有老鼠重复实验。
另外你老板这样也挺不利的，因为如果他想过一两年再用这个老鼠弄别的project的话
，想再买别的老鼠交，背景就更不可控了，所以一般是实验室会同时建立个纯系备用吧
。 |
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s******y
发帖数: 220 | 40 理论上写proposal不提就好了，但是我们那个解释现象的hypothesis 不是很直接，我
跟人讨论过，人家死活不buy，觉得应该有个alternative的来back up一下。
如果这个会成为一个潜在问题的话，我是不是应该不提 mixed genetic background 呢？
我们老板不懂老鼠，他们前面characterize disease model 的paper 就悲剧了，mixed
genetic background 被点出来批评了。
看来我还是早点开始backcross的好啊。 |
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s******y
发帖数: 220 | 41 多谢指教！
其实我们最初的double mutant disease model 就是mixed 的， （主要是FVB/N）, 后
来又转了个C56BL/6的磷酸化基因。我的确发现在这个新的mixed的背景下，老鼠病的没
那么严重了，死的慢了不少，虽然还是有病。 更让我担心的是，的确有一部分老鼠，
好像都不怎么病，也不知道为什么 （比如 兄弟两老鼠，哥哥1个月就挂了，弟弟活了
一年多）。 不过在这样一个相似的大背景下，很明显triple mutant中有S_A mutation
heterozygous的死的更快。
所以我觉得很明显genetic background 有影响phenotype，但是并不至于dramatic到让
他消失，（只是让penetrance 或expressivity 变弱了）。
根据你第一段，我应该证明在一个pure的background 下，这老鼠有病，我们的model相
关的基因是重要的，
但是根据最后一段关于back cross的 理论，我要是把这老鼠们backcross了，性状可能
会变弱，或者丢失，我到底该怎么半呢？
如果出现了丢失的状况，是不是就证... 阅读全帖 |
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r*******y
发帖数: 48 | 42 backcrossing many generations in Tg study results in delay in the onset,
less severity or (to the extreme) even disappearance of the phenotype,
particularly in the heart field, has been observed in many labs which have
been working on Tg models. In some cases this phenomenon has nothing to do
with the position effect, or with mouse genetic background, becaseu it can
occur on independent lines with the similar genetic background. some labs
therefore had to repeatedly do the microinjection to gene... 阅读全帖 |
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C**S
发帖数: 522 | 43 129小鼠KO后正常，backcross到C57后，雄性不育。两种老鼠之间有什么不同导致这一
现象，有什么可能的解释吗，可以做点什么？这个基因是在testis高表达的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 RE LZ
pls refer
PMID 21063464
Liu Y et al.
Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. (2010).
PLoS One. 25: e13533.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21063464
>There are at least two possible explanations for
>these discrepancies.
>One possibility is that after many generations
of backcrossing to the C57BL/6 background, the expression of the
randomly integrated RIP-CreER transgene is enhanced, thus
increasing the probability of its nuclear entry, even in tamoxifenuntreated
cel... 阅读全帖 |
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f*******n
发帖数: 141 | 45 1. 检查实验方法是否有问题
2. 选择inbreed小鼠，杂背景的小鼠backcross十代
3. 有些项目确实variation很大，那么样本量要增加 |
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r******g
发帖数: 600 | 46 B6 效率很低的
用129然后backcross效率好很多
并且founder mouse用crossbackground比较容易找啊 |
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l**********k
发帖数: 189 | 47 这个主要是为了动物种子的遗传稳定。我们知道任何动物，不管是不是近交系，时间、
代次多了，就会产生遗传漂移。还有就是不同品系之间的回交（backcross）等，需要
对遗传背景进行跟踪监测。这里不只是指genotyping。 |
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r******g
发帖数: 600 | 48 我是搞免疫的啊，其他领域都不是很懂～
但是，inbred的老鼠 比 没有backcross的老鼠 在免疫challenge（infectious agents
和autoimmune model）时候，往往有更严重的疾病phenotype!
另外，实验室广泛使用的inbred mice都是已经被筛选过的strain了~ |
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发帖数: 1 | 49 如果没有backcross。后代如果载体还在基因组里的话还会继续在target site 切吗？ |
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