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e***o
发帖数: 344 | 2 I thought for FRET, it is 10 nm. How about split gfp/BiFC? Thanks！
People are using split GFP (called GRASP) to reconstruct pre/post synaptic
split GFP and get good signal. The distance of synapse is around 20-40nm.
The extracellular part of XFG isnt big. I am wondering 10nm is good for split gfp/BiFC?
low |
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s*********g
发帖数: 16 | 3 各位前辈，本人正在找审稿机会，方向关键词为optical imaging （FRET/FRAP/FLIP/
BIFC）/ fluorescent proteins / biosensors （GFP-based）/ protein-protein
interaction / cell signaling/ ROS/ cancer biology/ Drosophila等，只要是用
optical imaging研究细胞生物学或是果蝇的文章，只要不是太high-profile的杂志，
应该都能handle的了。谢谢。 |
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D**A
发帖数: 311 | 4 老板在去年2月就告诉我和她共同第一作者，当时我已经做了半年，她刚开始PHD。
现在会有大概10个FIGURES，她贡献2个。因为她花很长时间克隆后做的BiFC没成功。
我提供BIOCHEMICAL DATA,她用免疫荧光验证。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 5 For 3 proteins, you may try BiFC-FRET for in vivo and real-time interaction
analysis. |
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b******s
发帖数: 1089 | 6 本来想当老好人。今天要揭竿了。
文章历经艰辛即将被接收。才发现自己从co first athor变成second author。以前投
的时候没太在意，发现没标注以为等到proof的时候在加上。今天问了老板才知道变成
second author了。
长话短说，只说contribution。main figures一共四个，我有接近2个。附图4个有一个
半。我们是做植物的，第一作者最早做这个突变体。他做了genetic和生理学的一些实
验。占着来得早把easy data都收集了。我做的是细胞学和机制的一些探讨。
细胞学就是细胞内定位，和胞内secretion system的colocaliation。用了confocal和
EM。这个gene理论上帮助蛋白移动，我用细胞学实验证明蛋白移动受了影响。蛋白间作
用第一作者用bifc证明，我用另一种方法也做了。但是文章是他写的，我其中花了很多
时间修改。老板认为我的data很多主动要加我为co-first author，我也一直是这么以为。
没想到第一作者小日本写了5封信"vigorous objections"。威胁不签字。我们老板AP，
很... 阅读全帖 |
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r******y
发帖数: 21907 | 7 这个激素问题很麻烦，从表型看貌似跟谁都没关系，关键是并不太影响生长，没有形态
学上的异常。查了genvestigator了，比较混乱。。。对了，你的protoplast咋样了？
我也要开始做BiFC了。 |
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r******y
发帖数: 21907 | 8 如果两个construct来源不同，能反应吗？比如一个是gateway system，一个是一pUC19
为Backbone的需要连接克隆的，两个分别带有N-YFP和C-YFP，这样转化后可能出结果么
？觉得不可能。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 10 只要能表达，理论上应该都可以吧。不过好像half YFP有不同的大小，大部分是从大约
150几个aa处断开，也有从174aa处断开（这种据说效率更好）。不同来源的片段应当检
查一下sequence。
pUC19 |
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r******y
发帖数: 21907 | 11 我也是怕YFP分开的地方不同，这个不是我经手做的，别人走了转给我的，回头不行
sequence看看，或者继续克隆，前面的人没有克隆出来所以才用两个不同载体做。。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 12 很多co-localization只是同是定位于胞内的compartments，并不能说明两个蛋白相互
接触和作用。
比如一个vesicle上可以有很多蛋白，但他们不一定要直接接触。
要直接证明，还是需要其他手段，live imaging可以用， FRET或者BIFC
生化的可以做pull down或者co-ip |
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I*****y
发帖数: 6402 | 13 都不太靠谱。
split gfp是说BiFC? 这个如果work了就work了，算你走运，如果不work，你连
troubleshooting都不知道咋下手。fret 相对还靠谱一点。
vs |
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X******n
发帖数: 914 | 14 Mammalian Two-Hybrid System的sensitivity 大概是25％，false positive偏高
MAPPIT的sensitivity 大概是35％，false positive据说很低，
如果蛋白是在细胞核的，可以试试Y2H，但sensitivity大概也是30％，而且会有假阳性
问题，
SPICA 据说sensitivity 非常高 75％以上，但是我估计假阳性也会很高，
PCA（或者BiFC),sensitivity <25%,有假阳性问题，
invitro binding assay |
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c*t
发帖数: 1063 | 15 被问到一个问题，不知道怎么回答，特来版上求助。
Immunostaining showed two proteins co-localize in the membrane, question is
to confirm that the two proteins directly bind each other.
First, I was thinking about co-ip, but this method does not exclude the
possibility other proteins are also involved, so it's hard to tell direct
protein binding with co-ip.
Second method I was thinking about is yeast two-hybrid, which is just to
detect the interaction of two proteins. But drawback is false positive.
Third method is a comb... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 17 Kit好用，但是很贵。一个盒子里没几个柱子。
我要做BIFC，有很多组合，需要提很多plasmids。想自己提纯。网上搜了一些protocol
，基本上都是盐沉淀之后酚氯仿纯化。试过发现转染效率都极低。我用的系统是植物的
protoplasts，有实验室用CsCL离心效果很好。想问问有没有更清洁安全的protocol？
谢谢 |
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b******s
发帖数: 1089 | 18 我以前也看到过。他们只用2ml的mini-prep，最后几个ul elute，然后做protoplasts
的转染，文章里说有70%的转染率。不知道你有没有试过？转染效率是否有这么高？我
要做BIFC，需要相对高的转染效率。谢谢 |
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H*g
发帖数: 2333 | 19 There are many ways to show protein-protein interaction; However, I would
suggest u to forget any additional in vitro assays. You already got IP and
pull-down, so do not waste time on other in vitro ones.
In your case, if I were the reviewer, I would directly ask for evidence from
other perspectives, in addition to all those in vitro assays. I would ask
for assays testing in vivo, real-time interactions, such as BiFC or FRET, as
well as any evidence demonstrating genetic interaction to support t... 阅读全帖 |
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j*****n
发帖数: 135 | 20 Split luciferase may give better read-out, but can't tell location of the
interaction. Check Hu C.D.'s paper on BiFC and use the best pair for your
experiment. |
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