c********b
发帖数: 363 | 1 楼上的思路不错。
其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
然后复性，最后该干嘛干嘛。
这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
我自己用的protocol是这样的：
如果只是检测蛋白表达:
用High SDS buffer:
15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
0.3 M DTT, 15% Glycerol
我的是植物细胞,一般是liquid nitrogen grind之后加buffer,boil.如果是cell line,
collect细胞之后加上buffer 然后直接煮.除非是非常不稳定的蛋白,不然连protease
inhibitor都可以不加.
看到蛋白之后如果是做IP:
先crosslonk(用什么chemical得自己琢磨),然后把ripa的SDS含量加到1% ,... 阅读全帖 |
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A****w
发帖数: 244 | 2 不是高手，不觉得有specifi interaction，很小的热量估计来自dilution。
到6.5 molar ratio还是有一点点热。。。
蛋白浓度是多少啊？peptide的浓度呢？
另外不知道你所谓的本底做了那些，有buffer to buffer, peptide to buffer, and
buffer to protein三组，你都比较过吗？
其他的就是你用的buffer是不是prefectly matched（同一batch buffer，蛋白透析好
。。。） |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/00032697829011
Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH ☆
Tracy McLellan
Analytical Biochemistry
Volume 126, Issue 1, October 1982, Pages 94–99
Continuous electrophoresis buffers are described for polyacrylamide gels at
pH values ranging from 3.8 to 10.2. The buffers consist of an acidic and a
basic component with pK values near the pH of the buffer. The pH is
maintained to within 0.5 pH unit in the electrode compartments duri... 阅读全帖 |
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O**********a
发帖数: 317 | 4 很简单，我给你个protocol：
1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
清晰的三条组蛋白带（H3、H2A／2B，H4），一般还能看到上面一条组蛋白H1。weste... 阅读全帖 |
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n**********g
发帖数: 196 | 5 哈哈，说个搞笑的，我们的感受态细胞一直我们自己做，一直很好。但是2010年前配的
buffer管用，从此之后的buffer一直不在work，新买了各种Sigma试剂，最终结果依然
是old buffer可以，新的一直不可以。2013年用完最后一滴old buffer后，改用公司的
kit，到现在都不知道不work的原因，我只好把他归结为旧的buffer用完了，哈哈
buffer |
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发帖数: 1 | 6 最近做一个DNA damage的实验，就是用H2O2来诱导Hek细胞基因组oxidative damage；
然后用FPG这种能识别8-oxoG的酶来切，被切的基因组位点会产生nick，阻碍PCR
polymerase，基于这样的原理做qPCR定量来研究某段序列对于oxidative damage的反
应。
好像这种做法比较少见，大部分DNA damage的研究都是global的。但也有很好的先例比
如：
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6994/abs/nature02661.html
这篇经典的Nature 文章
我按照这篇文章的做法，把genomic DNA进行FPG overnight digestion （DNA+FPG+Neb
buffer+BSA），同时也做了mock control（DNA+水+Neb buffer+BSA），然后qPCR发现
Ct如下：
DNA：25
DNA+FPG+buffer：28
DNA+水+buffer： 28
让我惊讶的是，相比于纯DNA，mock control的DNA+水+buffe... 阅读全帖 |
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j****9
发帖数: 2295 | 7 Sprintf(buffer,"%c",ESC);
Send(buffer);
Sprintf(buffer,"%s",message);
Send(buffer);
Sprintf(buffer,"rn");
Send(buffer); |
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c*********t
发帖数: 2921 | 8 谢谢你的回答。
对buffer overflow我还是不太理解你说的"The malicious client could change the
return address in the oversized buffer to run its own code. "
"return address" 你指的是什么？
是不是在client发给server的超长buffer里，client恶意的包含了一些malicous 代码
(如果这些代码在server上运行，就会造成危害)？在server上，server 用这个
oversized buffer覆盖了它的原来的一部分执行代码，当CPU 执行到这里时，就开始运
行从client带来的malicious 代码了？可是我的问题是client是如何知道在server上什
么地方copy 了这个oversized buffer, server就会出问题呢？ |
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K*****n
发帖数: 65 | 9 For Problem 2, copied from Visual Studio
;memmove - Copy source buffer to destination buffer
;
;Purpose:
; memmove() copies a source memory buffer to a destination memory
buffer.
; This routine recognize overlapping buffers to avoid propogation.
; For cases where propogation is not a problem, memcpy() can be used.
;
; Algorithm:
;
; void * memmove(void * dst, void * src, size_t count)
; {
; void * ret = dst;
;
; if (dst <= src || dst >= |
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S**I
发帖数: 15689 | 10 ☆─────────────────────────────────────☆
recursive (递归) 于 (Mon Apr 11 10:56:49 2011, 美东) 提到:
大半夜收到HR的thank you note。不用管什么NDA了
本人ECE fresh PhD，背景是电路/EDA，跟G业务基本没什么关系
同学内部推荐的，很简单的一次电面就给了onsite
题都不难，但是自己没把握好机会，出了一些小bug。
总的感觉，出错就是硬伤，宁可从最简单的算法写起，也不能出错。
电面：
1，Skip list， http://en.wikipedia.org/wiki/Skip_list
写code实现struct skip_list * find(struct skip_list *head, int value)
2，sorted array with repeated elements
for given element, find out its range.
e.g. A A B B B B B C C D D E F G, given B, the out... 阅读全帖 |
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S**I
发帖数: 15689 | 11 ☆─────────────────────────────────────☆
gzou (gzou) 于 (Thu May 12 02:26:35 2011, 美东) 提到:
马上就要G on site了，
求祝福。
下面是从本版收集到的Google的试题，便于大家查询。
申明：有的附带有解释说明的，也来自于本版或者网络，大家自己看， 不保证真确
http://www.mitbbs.com/article_t1/JobHunting/31847453_0_1.html
本人ECE fresh PhD，背景是电路/EDA，跟G业务基本没什么关系
同学内部推荐的，很简单的一次电面就给了onsite
题都不难，但是自己没把握好机会，出了一些小bug。
总的感觉，出错就是硬伤，宁可从最简单的算法写起，也不能出错。
电面：
1，Skip list， http://en.wikipedia.org/wiki/Skip_list
写code实现struct skip_list * find(struct skip_list *head, int value)
2，sorted array... 阅读全帖 |
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S**I
发帖数: 15689 | 12 ☆─────────────────────────────────────☆
gzou (gzou) 于 (Thu May 12 02:26:35 2011, 美东) 提到:
马上就要G on site了，
求祝福。
下面是从本版收集到的Google的试题，便于大家查询。
申明：有的附带有解释说明的，也来自于本版或者网络，大家自己看， 不保证真确
http://www.mitbbs.com/article_t1/JobHunting/31847453_0_1.html
本人ECE fresh PhD，背景是电路/EDA，跟G业务基本没什么关系
同学内部推荐的，很简单的一次电面就给了onsite
题都不难，但是自己没把握好机会，出了一些小bug。
总的感觉，出错就是硬伤，宁可从最简单的算法写起，也不能出错。
电面：
1，Skip list， http://en.wikipedia.org/wiki/Skip_list
写code实现struct skip_list * find(struct skip_list *head, int value)
2，sorted array... 阅读全帖 |
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g*********e
发帖数: 14401 | 13
我能想到的是 让程序自己维护一个全局的buffer 用这个buffer来作为缓存。这样
malloc只要在buffer里malloc即可 不需要system call。buffer满了就整个copy到内存
里 清空buffer。
读/free的话首先确定要读的obj在不在缓存里，在就直接读，不在就swap成包含obj的
缓存。
tricky的地方是需要确定obj在缓存里还是只在内存里。 |
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w********g
发帖数: 106 | 14 来自主题: JobHunting版 - 小公司面经 knowledge题和coding都很常见，就不说了。
但是有个题我不知道考点是什么：
已给出全局变量
struct val {
char *s;
};
struct val input[100];//已事先存好100个val
struct val output[100];//已事先存好100个val，但都是任意赋值
char buffer[足够大];
要求写两个函数
InputToBuffer(void *buffer, struct val input)
BufferToOutput(struct val output, void *buffer)
第一个函数把input放到buffer里，第二个函数反之。
要求把两个函数依次执行完之后，input和output相等。
题目虽然稍微有些繁琐，但是其实意思很明确。
原题特意说过不必考虑内存不够用、字符串与结构体不valid的情况。
我不明白这题考点是什么，谁给我讲讲？
我的做法就是定义一个char *b = (char *)buffer，
然后两个函数里分别
memcpy(b, input[i], size+1)
memcpy(o... 阅读全帖 |
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b*********n
发帖数: 1258 | 15 可以在300个counter的同时，再用300个timestamp，把counter and timestamp它们放
到同一个slot
getHit 的时候，把这300个slot加一遍，就可以了
300个slot扫一边，应该很快。
我觉得这个逻辑比较简单。
不知道是否忽略了什么问题。
import java.util.Date;
class Solution {
public static void main(String[] args) throws InterruptedException {
Answer ans = new Answer();
ans.hit();
ans.hit();
ans.hit();
Thread.sleep(1000);
ans.hit();
ans.hit();
System.out.println(ans.getHit());
}
}
class Answer {
Item[] buffer;
... 阅读全帖 |
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s********u
发帖数: 1109 | 16 写了一下感觉真的挺难，要考虑的太多了，比如以前剩下的渣渣，size到顶了也要
return，或者read4（）进来如果返回值不为4是不是意味着后面就没数据了？那么size
还没到就要return。
写了一下，应该还能优化：
int Read4(char *buffer);
int Read(char *str, int max_size){
static int curPos = 0;
static char *buffer = new char[4];
int size = 0;
int readSize = 0;
int saveSize = 0;
if( curPos != 0){
readSize = 4 - curPos;
saveSize = min( readSize, max_size - size );
memcpy( str + size, buffer, saveSize );
size += saveSize;
}
... 阅读全帖 |
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d*k
发帖数: 207 | 17 I really hate to be the one pointing it out.
For one thing your condition in the while clause is obviously wrong. You'll
overflow str until read4() is exhausted. For another, consider the case when
read4 is exhausted and returned 2. Suppose your code did return right
answer for the current call. Then curPos will be 2. In the next call you'll
first move the last two bytes in buffer to str, these two bytes are not what
you believe they are.
I'm sure there are other cases that your code can't pass.... 阅读全帖 |
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l********s
发帖数: 358 | 18 我随手写了点java code，不知道对不对，其实就是需要个4K bytes的临时buffer暂存
一下。
// Given read4K(char[] buffer)
int read(char[] array, int N) {
char[] buffer;
int start = 0;
int end = 0;
int p = 0;
array = new char[N];
while (N > 0) {
if (start == end) { // Read next 4K bytes
start = 0; end = read4K(buffer);
}
if (end == 0) break;
int size = Math.max(N, end - start);
for (; start < size; start++) array[p++] = buffer[i];
N -= size;
}
}
但我不理解楼主提到的大文件优化问题，楼主能不... 阅读全帖 |
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r*******e
发帖数: 971 | 19 有，看我的。
public class Solution extends Reader4k {
private int offset;
private int size;
private char[] buffer;
public Solution(){
offset=0;
size=0;
buffer = new char[4096];
}
/**
* @param buf Destination buffer
* @param n Maximum number of characters to read
* @return The number of characters read
*/
public int read(char[] target, int n) {
int readbytes=0,step=0;
boolean isEnd = false;
whil... 阅读全帖 |
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d*******8
发帖数: 23 | 20 版中大多数面经都是针对北美new graduate的, 在此贡献一下本人国内找北美工作的一
些经验吧, 也算是答谢mitbbs上分享面经的朋友对我的帮助. 更希望攒攒人品能够抽到
h1b签证 :)
[背景]
国内4年工作经验. 硕士毕业后一直在某做存储的外企工作.
14年7月份开始有出国打算并开始准备.
[准备]
在工作之余每天坚持至少刷3~4道算法题, 并关注各个公司的blog及github上的开源项
目.
1. 算法
Leetcode自然不必说, 必刷. 先是用了将近两个月的时间把leetcode刷了1.5遍, 然
后每次电面和onsite面之前挑一些觉得做得不好的题再刷.
其次就是看geeksforgeeks上题. 这是个老印host的网站, 但是上面的题目分类明晰
,有很多分类底下的题目非常好, 比如DP (印象最深的就是m个鸡蛋n层楼测在哪层楼鸡
蛋会被摔碎的问题)和graph (印象最深的就是单源/多源最短/最长路径和欧拉环). 每
天看一下还是能学到不少新鲜的知识的.
其他就没有了, career up和glass door也断断续续看了一些, ... 阅读全帖 |
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d*******8
发帖数: 23 | 21 版中大多数面经都是针对北美new graduate的, 在此贡献一下本人国内找北美工作的一
些经验吧, 也算是答谢mitbbs上分享面经的朋友对我的帮助. 更希望攒攒人品能够抽到
h1b签证 :)
[背景]
国内4年工作经验. 硕士毕业后一直在某做存储的外企工作.
14年7月份开始有出国打算并开始准备.
[准备]
在工作之余每天坚持至少刷3~4道算法题, 并关注各个公司的blog及github上的开源项
目.
1. 算法
Leetcode自然不必说, 必刷. 先是用了将近两个月的时间把leetcode刷了1.5遍, 然
后每次电面和onsite面之前挑一些觉得做得不好的题再刷.
其次就是看geeksforgeeks上题. 这是个老印host的网站, 但是上面的题目分类明晰
,有很多分类底下的题目非常好, 比如DP (印象最深的就是m个鸡蛋n层楼测在哪层楼鸡
蛋会被摔碎的问题)和graph (印象最深的就是单源/多源最短/最长路径和欧拉环). 每
天看一下还是能学到不少新鲜的知识的.
其他就没有了, career up和glass door也断断续续看了一些, ... 阅读全帖 |
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q**u
发帖数: 12289 | 22 buffer tube制作工艺不同，导致强度不同，价格不同。
milspec是在buffer tube上缠绕出螺纹，也就是说螺纹部分的管壁厚度不减，所以理论
上更结实。commercial是在buffer tube上削出螺纹，也就是说螺纹部分的管壁厚度比
其它部分要薄，但是工艺简单造价低。因为下机匣的螺纹孔径都是一样的，所以
milspec的buffer tube要比commercial的buffer tube略细一些。 |
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S*A
发帖数: 7142 | 23 这个做个 soil test 会告诉你 pH 是多少。还有另外一个是 buffer pH.
buffer pH 是你土壤自然的 pH 值. 例如，你的 pH 是 7.0 你的 buffer pH
是 7.1. 你添加酸性的东西到土壤，这个 pH 会降低, 比方说 5.0。但是过
一段时间，这些酸性物质被消耗掉，pH 又会慢慢回归到 7.1 附近。也就是
说 buffer pH 是你的土壤没有外界添加东西的自然的 pH. 添加东西可以临时
改变 pH, 长期又会回归到 buffer pH.
你要把 pH 降那么底的话是一定要完整的 soil test 的。你需要知道你土壤
里的其他金属离子的含量。pH 低的时候，金属离子就大量进入水里。过高的
金属离子（比较常见的是铝）会毒死植物的。这是为什么很多人的土壤要用
lime 来升高 pH, 降低金属的毒性。如果你的土壤不适宜降低 pH 的话，
大概也没有什么你可以做的。除非完全换土。土壤能够调整的范围非常有限的，
这是逆水行舟的事情，最常见还是因地制宜，根据你有什么土争取种什么东西。
吗？ |
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n**t
发帖数: 45 | 24 【 以下文字转载自 Biology 讨论区,原文如下 】
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（五）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:57:06 2005) WWW-POST
本文献给YL
（五）"万金油"buffer
Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用
coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述
一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一
封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这
个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神
乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方 |
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w********2
发帖数: 16371 | 25 版面有果黑在骂，我就去查了下，感觉还是不错的技术：
http://www.anandtech.com/show/6406/understanding-apples-fusion-
During its iPad mini launch event today Apple updated many members of its
Mac lineup. The 13-inch MacBook Pro, iMac and Mac mini all got updated today
. For the iMac and Mac mini, Apple introduced a new feature that I honestly
expected it to debut much earlier: Fusion Drive.
The idea is simple. Apple offers either solid state or mechanical HDD
storage in its iMac and Mac mini. End users have to choose betwe... 阅读全帖 |
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t*****s
发帖数: 124 | 26 设置优化都是跟你的应用相关的
旁人很难给你很具体的建议
你最好把slow query log打开
然后针对任何超过2秒以上的query进行分析,优化设置以及index
另外，你的key buffer,sort buffer和read buffer的size都太小
这些buffer size跟query的performance关系很大
建议你尽量设置大一点，比如256M
如果内存够用，还可以考虑设置得更大一些，尤其是key buffer |
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c*******n
发帖数: 671 | 28 谢谢，以下是我的X11/xorg.0.log, 我看不出来什么问题？是的我不应该删lightdm，
不是那个的问题。startx会出现我上面帖子写的Loading extension GLX, fatal
server error: no screen found. 请问我该怎么修复xwindow? 谢谢！
[ 4.113]
X.Org X Server 1.13.0
Release Date: 2012-09-05
[ 4.113] X Protocol Version 11, Revision 0
[ 4.113] Build Operating System: Linux 3.2.0-37-generic x86_64 Ubuntu
[ 4.113] Current Operating System: Linux x-ThinkPad-X201 3.5.0-49-generic
#74-Ubuntu SMP Fri May 2 23:28:58 UTC 2014 x86_64
[ 4.113] Kernel command line: BOOT_IM... 阅读全帖 |
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f*n
发帖数: 254 | 29 【 以下文字转载自 Programming 讨论区 】
发信人: fin (节日没有不祥和的), 信区: Programming
标 题: 问一个vim的问题
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 5 15:04:45 2012, 美东)
如果不想保存文件，想直接比较两个文本内容，用vim来做，想开一个buffer，选中第
一个版本的文本，paste到该buffer上，再开一个新的buffer，选中第二个版本的文本
，paster到新buffer上，比较两个buffer的内容区别，请问该在vim里如何操作？ |
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r*********s
发帖数: 2157 | 30 我用下面的， 然后 C-c o 交换两个windows
;; transpose(interchange) two windows
(defun his-transpose-windows (arg)
"Transpose the buffers shown in two windows."
(interactive "p")
(let ((selector (if (>= arg 0) 'next-window 'previous-window)))
(while (/= arg 0)
(let ((this-win (window-buffer))
(next-win (window-buffer (funcall selector))))
(set-window-buffer (selected-window) next-win)
(set-window-buffer (funcall selector) this-win)
(select-window (funcall selector)))
(setq arg (if (plusp arg) (1- arg) (1+ arg |
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m*******o
发帖数: 264 | 31 #include
using namespace std;
char* f(int i);
void main()
{
cout << f(1) << endl;
}
char* f(int i) {
char buffer[20];
strcpy(buffer, "test");
return buffer;
}
函数f到底返回的是什么，应该是个指向char类型的指针吧。
但为什么cout << f(1); 输出的是整个array: test?
还有return buffer; 返回的是buffer[20]的初始地址吧？
返回指针的函数的返回值必须是个地址吗？ |
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g*********s
发帖数: 1782 | 32 在做IO优化。原来有大量fread操作，现在想精简成一次读到一个buffer里，从里面取
出data。有没有这样现成的库函数啊？
C++的binary stream应该可以把？但上次有个讨论说C++的binary stream比较慢？
原来的code：
for (int i = 0; i < count; i++) {
int x;
fread(&x, sizeof(int), 1, input_fp);
long y;
fread(&y, sizeof(long), 1, input_fp);
}
现在想改成：
void** buffer = new char[count];
fread(*buffer, sizeof(char), count, input_fp);
for (int i = 0; i < count; i++) {
int x;
bufferRead(&x, sizeof(int), 1, buffer);
long y;
bufferRead(&y, sizeof(long), 1, buffer) |
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f*n
发帖数: 254 | 33 如果不想保存文件，想直接比较两个文本内容，用vim来做，想开一个buffer，选中第
一个版本的文本，paste到该buffer上，再开一个新的buffer，选中第二个版本的文本
，paster到新buffer上，比较两个buffer的内容区别，请问该在vim里如何操作？ |
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T********i
发帖数: 2416 | 34 大家工作的领域不一样。我理解你说的socket buffer overflow什么意思。但是我的系
统保持CPU 100%有我的道理。
强实时系统，唯一的不确定性就是memory cache miss。我的系统有很多buffer，不只
socket buffer。确保不会overflow很简单。就是确保consumer比producer消耗的快。
我的系统，consumer的速率比producer的速率高一个数量级。就是为了提供足够的余量
。因此有任何buffer overflow检测到，直接crash，因为肯定是程序写错了。
至于socket buffer，其实最容易控制。TCP本身就有flow control，UDP实现一个也简
单。实际应用中，我们的message rate的上限都是已知的。因此设计起来很容易。
至于保持CPU 100%，主要是消除context switch。这个只有我这种系统才有这种需求。
大家做事情的思路完全不一样，没有可比性。我是用效率换延迟。你们不可能这么用。
至于你的见识，我挺佩服的。
dollar |
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h**********c
发帖数: 4120 | 35 DMA to system buffer I guess. So from system buffer, it still needs read it
to application space. DMA to application space, it is a big security whole.
From system buffer (I think it is socket buffer) to application space, there
needs cpu overhead.
Is select(),test socket buffer or test NIC event? |
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g*s
发帖数: 12 | 36 Here are two approaches to handling an input
file of arbitrary size:
A. Use a library or syscall that lets you determine the size
of the file. malloc a buffer to be that size. Then read
chars into the buffer until you hit EOF.
B. Malloc a buffer of a specific size. Read chars until
you hit that size, or EOF. If you fill the buffer,
use realloc to get a larger buffer.
From a security perspective, which is better? Why?
谢谢 |
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r****o
发帖数: 105 | 37 本文献给YL
（五）"万金油"buffer
Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用
coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述
一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一
封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这
个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神
乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycero |
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b**y
发帖数: 86 | 38 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10u... 阅读全帖 |
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f*****s
发帖数: 104 | 39 最近用GE healthcare的glutathione sepharose 4B resin purify a couple of GST-
tagged transcription factor DNA binding domains. The protein were bound to
the beads with high efficiency. However, when I used glutathione buffer to
elute the GST-protein off the beads, they can't be eluted. I tried 10 mM ,50
mM and 100 mM glutathione. To make the buffer, I diluted 1 M Tris (pH 7.5
at room temperature) to 50 mM, and added glutathione powder. There was also
2 mM DTT in the buffer. The elution was carried out... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 351 | 40 I asked the same question before on Histonet and other forum but never got a
satisfactory answer. :-(
I was doing in situ hybridization using TBS or PBS and came across another
protocol using Maleic acid. Then I went back and checked the data sheet
coming with the anti-DIG-AP antibody (Roche), and found that they suggested
using Maleic acid based buffer for "membrane application" and Tris-based
buffer for "other application".
Maleic acid has less buffering capacity than Tris in the pH range of 7... 阅读全帖 |
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b******r
发帖数: 111 | 41 Note: NHEs is membrane proteins that transmembrane 12 times. NHE5 is
localized to the plasma membrane;NHE6-9 reside on organellar membranes(
endosome,Golgi);
1. pcDNA transfects NHE5-9 through Fugene 6(ratio is 3 uL of Fugene/2 ug of
DNA) in 293 cells. After three days,collect cells.
2. Cold PBS washes cells. Add 150 uL of lysis buffer(final concentration:
50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% triton, 0.1% sds, cocktail inhibitor)
into each well of 6-well plate. Scrape cells.
3. The lysate gets st... 阅读全帖 |
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m**********d
发帖数: 137 | 42 IHC及IF显示蛋白A在tumor cell的细胞核里高表达，蛋白A的canonical function是与
蛋白B bind并激活B。一些preliminary data提示蛋白A有新的功能，就是与蛋白C
bind而调控另一个重要的生物过程。
现在需要得到A与C直接作用的证据，下面这个用Dynal magnetic beads做CO-IP的
protocol：
10μl Dynal beads coated with protein A+10μl Dynal beads coated with
protein G each reaction, wash with ice cold PBS plus 5% BSA, three times.
Incubate with antibody against 蛋白A (20μl, approximately 4μg) in 500μl
PBS plus 5%BSA, overnight.
2^106 cells/10cm plate, treatment (which induces A and C interaction while
... 阅读全帖 |
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V********n
发帖数: 305 | 43 仅供参考。
可能出的状况
1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
件可能不能太极端，需要摸条件。 |
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x*********a
发帖数: 24 | 44 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT,... 阅读全帖 |
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j****n
发帖数: 3370 | 45 试过常规的optimization没，例如退火温度，可以做个gradient试试或者touchdown
还是不行的话，可以考虑换enzyme或者buffer
推荐epicentre的FailSafe™ PCR PreMix Selection Kit
有12种不同离子强度的buffer 从适合高AT的A buffer到适合高GC的L buffer
对于某些特殊的基因，只有某一种或两种buffer好用 其他的都不行 |
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m**n
发帖数: 9010 | 46 中医与西医都有经验科学的成分.
差别在于经验是如何得来的, 以及对经验的解释.
比如说, 甲状腺素, 对人体的作用 - 这东西谁能真正
微观解释? 显然是通过无数的病例或者动物实验得来的
结论. 这些, 就是经验. 只不过是更科学系统的经验总结.
西医在这方面, 研究得更微观, 更注重病理.
中医呢, 在"症状"与"解决方法"之间, 有一个buffer, 就是
中医的理论系统. 西医这个buffer不明显.
所以中医可以号称自己不是仅针对某症, 而是全面调理.
因为可以通过这个buffer来调整针对性.
可以号称西医是头疼医头, 脚疼医脚.
这说法显然不完全对, 但从一个侧面说明了我前面的观点.
中医这个"buffer", 一些人认为是完全的胡说八道.
我的理解是 - 你别把它当成深奥的理论, 就把它当成
一些代号与规律. 别去在乎它说的那些"为什么", 只去考虑
它的结论.
我个人认为, 这个buffer有太大的不确定性, 对一般人来说,
难以准确的理解(也就是难以判定什么是对, 什么是错).
但我不排除有人就是有用这类语言理解问题的天赋. |
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m**n
发帖数: 9010 | 47 我前面不是说的很清楚了, ‘药’和‘症状’这两个因素中间有个
buffer. 这个buffer, 中医比较虚, 或者, 用版主的话, 叫抽象.
西医比较实, 或者, 叫"具体".
这, 就是你说的"理论". 我从来没有说"中医没有辩证没有理论".
我说的, 就是你避免不了辩证与理论. 而中医的这部分, 比较玄虚.
就你那个例子, 症状与用药, 中西医各有各的事实与处理, 我们不讨论.
就讨论中间这个buffer.
西医的buffer是实的, 针对可测量或可观察的东西, 比如"甲状腺素异常"
"血压高". 这都有很具体的对应.
然后根据以前的研究(可能是经验, 比如什么药对具体
什么东西有什么效果; 也可能是病理, 比如, 我就知道拿手术刀可以切
掉瘤子)做处理.
中医的buffer是虚的, "肝经异常", 这既不是症状, 也不是治疗方法, 而是
中医的理论说法. 它没有一个很具体的对应(如果有, 就不"抽象"了).
你说:从中医里的‘症状’到‘疗法’是不
可能靠生活经验总结出来的，不是人类可能完成的事情，非强大理论支撑不可。
我无异议. 我说的就是这个"强大理论"比较抽象. 既然... 阅读全帖 |
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n***5
发帖数: 1 | 48 就是 jitter buffer之类引入的延迟，
简单说：由于网络等各种因素，数据包流到达用户端时包的间隔时间是变化而非固定的
。用户端就引入一个jitter buffer来平滑delay，间隔时间变化的数据包流这样的
buffer，就可以相对恒定的包间隔来取出buffer中的包。引入的jitter buffer自然会
产生额外的delay，这就是playout delay。 |
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s********k
发帖数: 6180 | 49 这两个buffer在物理上是一个还是两个buffer，还有就是这个buffer是独立5层架构之
外还是属于某一层？（比如flow control的buffer在MAC，congestion control的
buffer在IP？） |
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o**********e
发帖数: 18403 | 50 【 以下文字转载自 SanFrancisco 讨论区 】
发信人: onetiemyshoe (onetiemyshoe), 信区: SanFrancisco
标 题: 面完fb,结果已经出来了，share下被拒的原因（请转jobhunting版 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 19 21:05:36 2014, 美东)
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 面完fb,结果已经出来了，share下被拒的原因（请转jobhunting版
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 20:46:44 2014, 美东)
考了下古，发现这位哥们的转贴，基本可以确认是一个人，基本可以确定这个是我被拒
的原因
同样迟到了大概5分钟，闲扯了十分钟左右，然后read4,确实很简单，但是给的题目非
常不清楚，所以完全没有考虑buffer里面留下的部分，中间我问了除了输出int,需不需
要考虑读出的字符放在哪里，被他含混过去了。自己没做过底层的东西，竟然也没有看
到这个帖子，细节基本一致，因为题目很简单，所以35分钟内... 阅读全帖 |
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