h**********r
发帖数: 671 | 1 不知道版上有没有同修用BioBrick？例如NEB的http://www.neb.com/nebecomm/products/productE0546.asp或iGEM的。我以前没有接触过。最近要从别的实验室要到一个质粒，带有BioBrick。我有几个疑问：
1. 扩增克隆质粒是不是必须用E. coli DB3.1?
BioBrick上带有ccdB。ccdB is a lethal gene that targets DNA gyrase。E. coli
DB3.1上有gyrA462的突变。可是JM109，DH5a还有XL1-Blue上有gyrA96的突变。实验室
没有DB3.1，但有JM109。不知道可以替代不？Invitrogen有新一代的One Shot®
ccdB Survival 2 T1R Competent Cells出来。可是贵啊，没有买感受态细胞的
习惯。
2. 虽然ccdB是个negative selection marker,感觉不像sacB那样有用,在biobrick里面
有点多此一举吧。还是我的理解不够深入？
http://partsregistry.... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 2 我做gateway三片段连接也总是遇到这样的情形。基本都是false positive的。
甚至只有两个片段连到载体上也能长。
但是我的BP反应一般都没什么问题。你的false positive的是丢了ccdB的载体还是连了
别的奇怪的片段？ |
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g*********3
发帖数: 177 | 4 When I prepared PLXSH-gateway, I use Amp+Chloramphenicol.
After LR, I use AMp only to do transformation and miniprep.
[At this point, CCDB is out and I don't use Chloramphenicol.]
Is this what you mean?
Thanks a lot. |
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L*****t
发帖数: 56 | 5 你把pLXSH空载体转DB3.1之类耐ccdB的菌株，Amp+CM平板划线挑几个克隆做Miniprep再
试试看。
我以前听人提过慢病毒系列的Gateway载体因为重复序列较多，存放久了构象会改变导
致克隆失败，但是本身序列没变所以重新转化提新鲜的质粒就行了。 |
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c*******e
发帖数: 5818 | 6 我能不能直接用PCR product为entry DNA做LR cloning，我的target vector has R4--
ccdB--R3，我想用PCR product has L4--PCR--L3，不知这样可以不。这样可以跳过BP
cloning。多谢 |
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