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w*e
发帖数: 740 | 2 以前用的nugen的，这次像富集mRNA,想试一下Clontech的smart-seq v4 这个rna-seq
kit。大家如何？ 拿到full-length cDNA 以后，大家是用nextera还是covaris＋low
input library prep kit （clontech）方法去做最后的library？
谢谢 |
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R*s
发帖数: 2041 | 3
Normally it takes 3-5 hours after transfection to express enough GFP protein
in cells to get detectable fluorescence. Another trick is that it will take
about 3 hours for the fluorophore on GFP to be oxidized so that it can be
fluorescent. As far as I know, the quickest detection of GFP (or other
living fluorescent variants from Clontech) is around 8 hours after
introduction of DNA. The earliest time I ever tried is 10 hours after
transfection, but it is weak.
However, if you really want to see |
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V**F
发帖数: 164 | 4 clontech website 说 2.5X brighter than EGFP
想在mammalian cell 里面建 promoter reporter line。
再考虑有没有必要用这个 ZsGreen1 GFP
各位有什么建议，麻烦不吝赐教啊。多谢多谢。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 5 Now I can't do the regular cloning work...
past several month fail to construct vectors....
someone use infusion system form clontech?
thanks. |
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m******5
发帖数: 1383 | 6 clontech说他们那个xfect转mES cell效率很高，有人用过么？
比lipofectamine如何？比电转如何？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 7 之前没留意过，近期突然发现，Clontech家的所有Lentiviral vector系统，包括其经
典的Tet-on/off/one lentivector，尽管宣传是最安全的第四代载体系统，但其中的
HIV-1 5'/3' LTR居然都是wildtype的而并非是被几乎所有其他商用载体所一致采用的
truncated/∆U3 LTR，作为self-inactivating (SIN) vector。这是件很奇怪的
事情，有哪位对Lentiviral vector比较熟悉的能讲讲吗？谢谢 |
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B******o
发帖数: 496 | 8 为啥要用clontech的？ sbi的选择多很多啊，除非你一定要inducible |
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 LZ please try below (I) to (IV) four strands overlap PCR
your target 7kp=2kp(I)+2kp(II)+2kp(III)+1kp(IV)
if you did not know downstream any conservative sequence information
your 3' RACE can use ligation-anchored PCR
就是用内切酶
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
对应的人工引物锚定long mRNA 的3'端 做人工锚定引物
i.e. by NotI it should be inserted to 3'端 5'GC---GGCCGC
from
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
Enzyme Source Recognition Sequence Cut
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGG... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 11 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后... 阅读全帖 |
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i****f
发帖数: 473 | 12 那么这个方瑞賢是何须人也呢,其实他和allen chao是一伙儿的
直接抄来的，繁体，大家见晾。
美西玉山科技協會通訊第198期/ 2006年5月號【4】
方瑞賢畢業於舊金山州立大學生物學系，印第安那大學分子生物學及微生物學博士。1984 年，他向弟弟借來三萬五千美金，並借弟弟實驗室的一個角落，創辦了全美第一家亞裔創辦的最大分子生物公司Clontech，並建立生技界基因庫的模式，1999 年底，他決定將Clontech 賣給著名的Becton Dickinson and Company 公司，當時Clontech 已有四百名員工，包括65 位博士，擁有五十多項專利，產品已達兩千多種，堪稱全球數一、數二的基因庫，提供全球三十多個國家基因實驗室或是學術界做研究之用。該公司曾於1994、1995、1998 及1999 年被聖荷西及舊金山商業報紙選為一百個成長最快的私人公司步上創業路，竟是一篇論文結的緣。
原來，方瑞賢在美國國家衛生局（NIH）做研究員時，讀到一篇論文，是出自史丹福大學一位白人研究員楊理察（Richard Young），內容是談他對發現新基因的過濾系統，引起方瑞賢很大的興趣。1 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 13 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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f***n
发帖数: 34 | 15 If your expression level is high, you don't have any problem with Clontech's
, but if your expressin level is very low, you will get proble. Also if you
use Clontech's kit to produce cDNA library, you will find that a lot of
clones are not full length, however abion's avoid this problem. This is just
from my experience. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 RE:
俺也参合一把
if GC rich >3kbp
first choice:
htp://www.clontech.com/FR/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR?sitex=10020:
22372:US#
htp://www.clontech.com/NO/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR/Long_PCR_and_GC
-Rich_PCR/Advantage_GC_2_DNA_Polymerase?sitex=10023:22372:US
then subcloning. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 with EGFP marker?
If yes,
Just go to
//www.clontech.com/US/Products/Fluorescent_Proteins_and_Reporters/Fluorescent_Protein_Antibodies/Gre
en_Fluorescent_Proteins
used it PNAS 2012 paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22215590
full text link:
//www.cas.zju.edu.cn/dky2008/userfiles/file/13287490419310.pdf
commercial EGFP-specific mouse monoclonal antibody
(Living Colors GFP, Clontech Laboratories)
or
PPT Slide Show:
//www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Program/104/6-09_
RachinskyAPHISprogressreportwebv... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 19 GC contents of that P2 to AscI site if >65% DMSO 5% to buffer or try
Clontech GC rich kit
Cycle time 35 that is no problem
pls refer
GC-rich PCR concerns DNA templates with high GC content, which is defined as
the percentage of guanine-cytosine base pairs. When amplifying templates
with >60% GC content (i.e 5' ends of most mammalian cDNAs), the three
hydrogen bonds shared by GC pairs lead to enhanced thermostability, which is
problematic for un-optimized Taq polymerase systems.
http://www.clon... 阅读全帖 |
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x*****9
发帖数: 48 | 20 光明网应该是国内主流媒体了，近日报道了一篇则鸣所写的文章：《科学新闻》不实报
道引发二方被打和肖传国入狱。光明网大概是这次肖方事件中唯一能持客观公平态度的
主流媒体。当然这几天其它一边倒支持方的主流媒体渐渐收声了，舆论有转向的趋势。
http://topics.gmw.cn/2010-10/04/content_1289408.htm
《科学新闻》不实报道引发二方被打和肖传国入狱
《科学新闻》不实报道引发二方被打和肖传国入狱
——兼评肖氏反射弧是否可能获诺贝尔奖
则鸣 刊发时间：2010-10-04 13:17:27 光明网综述整理 [字体：大 中 小]
Ke Hua,
I registered at the Rainbow Plan wed site as Ze Ming several hours ago
but didn't receive my password. Please either alert the web master to send
me my password, or post the article below for me.
I saw your e m... 阅读全帖 |
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x*****9
发帖数: 48 | 21 《科学新闻》不实报道引发二方被打和肖传国入狱
——兼评肖氏反射弧是否可能获诺贝尔奖
则鸣 刊发时间：2010-10-04 13:17:27 光明网综述整理 [字体：大 中 小]
Ke Hua,
I registered at the Rainbow Plan wed site as Ze Ming several hours ago
but didn't receive my password. Please either alert the web master to send
me my password, or post the article below for me.
I saw your e mail addresses in your message to Shen Yang. Thanks. --Ze
Ming
9月21日从吴发天的微博上看到肖传国被捕, 其震惊程度不亚于萨达姆被俘和迈克
尔·杰克逊猝死(都是先从网上看到). 方舟子被打后一直想看到凶手被抓. 特别是看了
刘菊花的《活着》, 对她和她的女儿充满同情. 肖传国被抓, 震惊之余是失望, 然后是
愤怒... 阅读全帖 |
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g******n
发帖数: 75 | 22 生物公司名
beckman
agilent
clontech
thermofisher
invitrogen
vwr
eppendorf |
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a********k
发帖数: 2273 | 23 最方便的办法，申请个专利。看你的产品是符合life tech, neb, qiagen, thermo哪个
的服务范畴，直接liscense给人家。你看clontech那些dry mix酶，哪个不比life tech
的简单好用？但是life tech的酶照样卖得比人家好。。。80%生物实验室用一个东西不
太现实，提DNA试剂都没有80%用。我实在想不出啥东西可以做到80%。即使你让别人用
了，价格还要比大公司便宜，QC还要过关。实验室是一个不太计较成本，但是又特别注
意稳定性的地方，所以你很难推新东西。。。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 24 最方便的办法，申请个专利。看你的产品是符合life tech, neb, qiagen, thermo哪个
的服务范畴，直接liscense给人家。你看clontech那些dry mix酶，哪个不比life tech
的简单好用？但是life tech的酶照样卖得比人家好。。。80%生物实验室用一个东西不
太现实，提DNA试剂都没有80%用。我实在想不出啥东西可以做到80%。即使你让别人用
了，价格还要比大公司便宜，QC还要过关。实验室是一个不太计较成本，但是又特别注
意稳定性的地方，所以你很难推新东西。。。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 25 80-20今年可以支持O8，以后可以转而支持共和党。关键是要让候选人看到亚裔的力量
。千万不要用意识形态绑架，从而分裂华人的力量。
honde的资料似乎有误，我来贴个80-20的领导人名单。
http://www.80-20initiative.net/about/organization.asp
Who are 80-20's leaders?
The first generation leaders
Tong S. Chung, Founding President, Korean American Coalition
Alex Esclamado, Nat'l President, Filipino-Am. Political Assoc.
Peter Suzuki, President, Natl Asian/Pac. Am Bar Assoc. (NAPABA, 98'-99')
Henry Tang, Governor, Committee of 100
Chang-Lin Tien, Chancellor, U. of Calif.... 阅读全帖 |
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N******e
发帖数: 56 | 26 向南大校友求助:
在下想要用pEYFP-Golgi mark我的细胞(果蝇的 S2 cell)的golgi body, 结果不幸的是,
clontech的这个vector不卖了....This product has been discontinued...
版上的各位大侠, 如果有这个vector,可不可以给我一点点, 在下不甚感激!!!
再次感谢! |
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M****e
发帖数: 70 | 28 For such microarray analysis, typically the mRNA is reverse-
transcribed into complementary DNA (cDNA) and labeled with
fluorescence dye or radioisotope. and the single-stranded
cDNA is hybridized to the complementary strand that is already
spread on the matrix with known position. i have only used
microarray from Clontech. theoretically, the RT enzyme with
gene-specific primers can reverse-transcribe the mRNA into
same amount of cDNA. otherwise, you cannot make the comparison
quantitatively.
fo |
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X***n
发帖数: 366 | 29 Addgene这么便宜地交换，谁还会去Promega, Clontech买啊？反正大家大部分都是non-
profit,academic。License说不能create backbone， 切掉insert，替换成我想要的，
算不算re-create backbone? 请指点。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 取决于你用的是哪个GFP, 如果是动物细胞里面用的，一般都是eGFP,
在clontech 的数据库里有。
如果是细菌里面用的，那可能是普通的GFP, 在pubmed里有 |
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s******r
发帖数: 2876 | 31 clontech的pEGFP-N1有全序列。
我需要克隆GPF到PDONR201,请问怎么查GFP的序列阿,谢谢 |
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O******e
发帖数: 14 | 32 PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
谢谢。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 33 Stratagene的Herculase II
在我手上比Invitrogen的platinum和pfx,neb的phusion要好
如果fidelity要求不是很高可以考虑clontech的advantage 2，产量绝对惊人 |
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c*****a
发帖数: 179 | 34 我喜欢takara，特别是旗下的clontech。后者真好啊，就是真贵啊
Fermentas和promega都属于那种还行，但是不会感慨“真好，真漂亮啊”那种 |
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s**e
发帖数: 1523 | 35 板配得对么？如果选择性培养基配得正确的话，假阳性可能性不大。另外如果使用3-AT
筛的话，可以titer它的量，满足说明书上的要求(我们用的是clontech的）。另外除了
选择性培养基的筛选，还可以加X-gal，然后看颜色变蓝没有。说明书一般都是很详细
的，可能还有专门给Y2H的manual，好好看看。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 36 Clontech’s Tet-On Advanced and Tet-Off Advanced Inducible Gene Expression
Systems可以用于任何人类细胞系吗? 怎么知道那个细胞系效果会更好,谢谢 |
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D**A
发帖数: 311 | 37 GFP TRAP
超级高效，省时，非抗体
POLYCLONAL ANTI GFP，CLONTECH，效果比ROCHE的好很多，但是价格稍贵。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 38 恩，俺在以前的Lab也用CLONTECH 的POLYCLONAL Anti-GFP，效果很好，价格贵不贵就
忘了，当时买了3管，有的IP非常好，有的只能做WB。 |
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r******d
发帖数: 24 | 39 病毒制备与浓缩是转染的关键。我一般是用10cm plate转染后12小时换液，48后收
virus（10ml)。浓缩可用clontech. Lentivirus Concentrator。
祝好运。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 40 用Herculase II的cDNA扩增的条件，或者clontech的advantage 2
我忘记我克隆GC rich用的哪个了，后者PCR产物肯定非常多，不过突变率有点高
带。 |
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f***n
发帖数: 34 | 42 I don't like clontech's RACE kit. Based on my expericne, a lot of cDNA are
not full length. |
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x******8
发帖数: 350 | 43 5RACE最重要的是你的RNA质量要好，其实clontech的挺好使的，ambion的比较复杂，我
就没有选。我已经全长克隆了3个基因。 |
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c****d
发帖数: 501 | 44 first, thanks a lot for the reply!
像我上边说的 我们最初就是用我老板的PBMC提RNA试了一下
用的是clontech的RACE的kit
结果批出来一大堆乱七八糟的东西里 还真捞出来一个IGHG1
可惜和genebank的序列align的结果有很多mutation，大概对上97%
我也不知道是pcr的fidelity的问题 还是个体差异
然后我们就用了CESS cell line, suppose是分泌IgG1的 而且刚好有我们要的membrane
bound form
repeat了同样的试验 这次批出一个非常specific的band， size也对
结果测序之后 竟然是完全不同的东西
blast了一下 发现target到genome上一个未知的loci
然后我就卡到这了 ：（
is |
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a*****n
发帖数: 2835 | 45 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+ |
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e****p
发帖数: 354 | 46 DSMO NESTED试了没有用，试试CLONTECH 吧虽然贵点 |
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m******5
发帖数: 1383 | 47 我觉得之所以不卖EGFP了是因为没版权了……
EGFP我觉得已经够亮了，ZsGreen用的人不够多有点怕 |
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a****d
发帖数: 1919 | 48 regular EGFP is fine for stable cell line, it's bright enough. Plus all
there are several great antibodies for EGFP, but not for other XFP. |
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a*****y
发帖数: 269 | 49 I think it is not a monomer. |
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e*******c
发帖数: 1479 | 50 最近课题卡在一个病毒表达体系上，我想利用一个病毒体系在我的肿瘤细胞中高表达一
个蛋白，我选择的是Clontech的pLHCX系统，但是利用几个细胞的方法去包装感染细胞
都不出任何稳定细胞系，比如PT67, phoenix 细胞等，请教各位如果有经验的提供点信
息。谢谢 |
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