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c*****g
发帖数: 21627 | 2
我见过了啊。既然你同意，我同意，所以我就没有再谈，OK
有本事不要反过来骂国男。外F反过来骂国男，不愤怒，难道还要学大法师“忍”着？
你说的是那个cmvmei吧，丫的确外F，而且净为黑人说话。丫还为AA叫好呢
附录：cmv语录集
http://www.mitbbs.com/article/FleaMarket/33501265_0.html
发信人: cmvmei (cmvmei), 信区: FleaMarket
标 题: Re: 今天苹果店遇到非常气氛的事。吞的下去吗？(更新)
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Oct 11 13:17:43 2012, 美东)
活该！看到楼主的遭遇，联想到脑残的果轮，今天好爽啊！
发信人: cmvmei (cmvmei), 信区: WaterWorld
标 题: Re: 外f大浪啥时候过去啊
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Oct 9 18:51:38 2012, 美东)
国男但凡有点优点也都被吹到天上去了。你说这帮中国来的理工男，不爱国、没好背景
、死读书、虚胖无力、邋遢油腻、没身份、口语不行、无幽默感、不会野外运动、萎缩
... 阅读全帖 |
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s******7
发帖数: 1758 | 4 多谢大家提供意见帮助，我已经配完了，就等着货到装机, e7200(CPU)+P5Q Pro Asus(MB raid)+2*500GB(hard drive)+2*1GB(ram)+ 4850显卡+650w PSU
用途：玩3d游戏，比如TOMB Raider: underground，CPU没啥要求，能跑游戏肯定能跑日常软件和看高清电影
今天总共花费： $521-$130(cashback&rebate)=$391
已经有的配件：
硬盘：western wd5000AAKS SATA-II 16MB Cache 7200rpm
大号机箱
DVD驱，2*1GB DDR2 memory(装xp 32位玩游戏)
显示器：chimei 22' CMV 222H (这个有没必要换个好点的)
我是急性子，一天之类全部配完了
显卡和电源：
Newegg has the Saphire Radeon HD 4850 512MB PCI-Express Video Card +
Thermaltake ToughPower 650W Modular Power Supply for $230 - $2 |
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O******e
发帖数: 4845 | 5 ☆─────────────────────────────────────☆
icepiao (icepiao) 于 (Sun Sep 17 00:44:40 2006) 提到:
我转染后利用Anti-V5-FITC进行荧光染色，买的是invitrogen的抗体，目的是看
plasmid transfection后一个protein的表达情况，V5是该蛋白的Fusion protein tag
，因此只要该protein表达，理论上V5应该也表达，基因的启动子是CMV启动子。
步骤为首先co-transfection，利用另外一个report plasmid看transfection
efficiency, 48小时后PBS洗两遍，利用100%甲醇固定5min,然后PBS洗5遍，2min每次，
加入含10%胎牛血清的PBS Block20分钟，然后加入荧光抗体，置暗处1h,然后荧光显微
镜下观察，但是在荧光显微镜下几乎什么也看不到，偶尔有几个有可能有荧光的细胞，
但是太少了。
随后我也采用了4% PFA fix 0.1%Triton x-100 permeabilize, |
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h**********8
发帖数: 650 | 7 Biomicro is right.
The purpose of Lentivirus is to get stable transfected cell line
Ordinary plasmid can get hight expression but is transient.
CMV promoter is virus promoter, cells can silcent it. I get this information
from my boss, but I have not found this paper. |
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n********k
发帖数: 2818 | 9 CMV is notorious for its silencing in ES and actually many promoters are
somewhat silenced in stem cells... and different lines/cell types are quite
different when come to which promoter to use... |
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d****i
发帖数: 2346 | 10 不一定。
xia haibin好像最早用了CMV promoter。现在陕西师大建了实验室。
还有就是如果你把你的shRNA涉及到内含子里面，转录后自动剪切，那么前面可以随便
用那种启动子。 |
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q*****n
发帖数: 331 | 11 Plasmid DNA does not replicate in mammalian cells.
The only thing they do is to provide a template for RNA transcription
because they all contain strong promoter such as CMV.
Becaue they don't replicate, their level will decrease and dispear after a
few days, that's why they are called "transient expression".
At low frequency, they may intergrate into genome, then they can replicate
along with the genome. You can use antibobitic to select this low frequent
clones, that is called "stable clone se |
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m****M
发帖数: 360 | 12 I transfected cells with linearized CMV promoter driven GFP, and GFP was
expressed at high level for over one weeks (until I tossed them). They are
pretty stable in cells, is not that easy to be degraded (DNA or protein). It
's easy to test that, just cut off the ORF and transfect it. |
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D*********t
发帖数: 370 | 13 Just fuse the 3' end to luciferase (more sensitive than GFP). Start with
whatever promoter you have in your plasmid (CMV, etc).
是, |
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j********r
发帖数: 156 | 14 An update - 10 days after seeding infected cell on feeder MEF (or 13 days
after initial infection), I found one ES-like clone. If it is IPS, the
efficiency is extremely low (one clone from 50000 cells seeded).
The virus might be the reason for that, but I am not sure about the quality
or titer of the virus supernatant I made from 293T cells (the ratio of OSKM
to CMV delta 8.91 to pMD2-VSVG is 4:3:1). Also this time I used frozen sup.
I will try fresh one next time.
The purpose of this experiment |
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j*********o
发帖数: 237 | 15 最近在做一课题，在两种人的肿瘤细胞系中瞬转siRNA knock down了某个基因，结果第
二天就发现细胞大量死亡，到第三天细胞基本死光光，同时做的non-targeting siRNA
control细胞生长正常，初步确认是这个基因的下调导致了细胞死亡。
但问题是，细胞死的太快了，试了好几个浓度，要么太低了没有RNAi效果，高了细胞就
翘了，导致无法具体分析细胞死亡的原因和后面的分子机制。
想过tet-on诱导性RNAi，但目前公司卖的tet系统基本都是用cmv promoter,似乎不能指
导shRNA的转录，但是可以知道microRNA转录，不知能否设计针对该基因的microRNA来
做诱导性的knock down? 至于如何设计不太了解，
没方向了，想请教一下在这方面有经验的同志，任何建议都欢迎！！
多谢先！ |
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w********u
发帖数: 5457 | 16 最近头都大了，要在老鼠的cell line里面过表达和knockdown一个gene，选了L929细胞
，觉得挺简单的试验，结果两个礼拜下来，杯具了。
先是knockdown，试了siRNA pool和shRNA plasmid （4 clones），均没有knockdown效
果。重新design了shRNA，准备再试。
又做了overexpression，openbiosystem买的construct，CMV promoter （pCMV－
SPORT6 plasmid），CDS测过序列，完全正确。转染了，western blot，又啥也没有高
表达。转染效率40％－50％。
目标基因是个胞质胞核穿梭蛋白，结合RNA，功能重要但研究文献不多，表达量各个细
胞不均一，但是knockout老鼠胚胎很早死亡，无KO老鼠。
请教有经验人士，可能是啥原因？是不是L929这个细胞朱就是不容易搞啊？如果是，有
啥别的老鼠细胞容易搞的？或者还是有别的可能？
谢谢拉！ |
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T**********r
发帖数: 287 | 17
我是往pancreas里注射，让adenovirus侵染pancreas，并且在pancreas里表达，这个技
术问题已
经解决了。我是想知道pAd/CMV/mCherry-linker-shRNAmir这样的设计是否合理。
linker是
polycistronic的2A。多谢答复。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 18 楼上正解，你需要dual promoter vector. CMV drives mCherry and H1 drives shRNA
expression separately |
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f****b
发帖数: 314 | 19 "The openbiosystems lentiviral vector includes a tetracycline inducible
promoter that produces tightly regulatable RNAi."
虽然我没有细看，但显然不是CMV那么简单的事情。你自己的实验，你自己要看清楚。 |
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c****y
发帖数: 14 | 20 请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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c****y
发帖数: 14 | 21 Hi, sinister (@_@),
If the CMV promoter is methylated to inhibit transcription, the protein
should be expressed after treatment with demethylation agent 5'Aza, right?
Can you suggest other good promoter for it? Thanks. |
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c****y
发帖数: 14 | 22 Hi, reuse,
对于lenti vector，infection后整合到染色体上，应该还是用CMV promoter, 对吗？
因为这儿没有internal promoter.
infection后可能质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表
达。请问如何避免这种情况发生？
谢谢！ |
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c****y
发帖数: 14 | 23 我认为我构建的目标基因有完整的结构：CMV promoter, kozak seq, full ORF, and
polyA signal. 还有就是瞬时表达正常，能够看到蛋白。请问还有什么需要考虑的吗
？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 24 谢谢楼上各位。我正在看这方面的文章，特别是七楼 jcb 老兄列出来的那篇，越看越
觉得不错。我做的蛋白目前没有 endogenous cell line，而我研究的方向也包括 mRNA
intron splicing。现在我都是用引入了 CMV promoter 的 BAC DNA 做 transfection
。看看这些文章我倒是想买点这个 ZFN 然后把 HEK293T 细胞的基因组改一改，改造出
一个可以 endogenous cell line 来。明天和 sigma 的 rep 继续谈谈。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 25 我猜在related products里面吧……
你去addgene买个3XFLAG的CMV promoter的plasmid，最好蛋白size也和你做的差不多，
自己做transfection…… |
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h**********8
发帖数: 650 | 26 推荐prosa, pef
适合做稳定转染，能否把CMV切掉换成其他启动子呢？ |
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h**********8
发帖数: 650 | 27 呵呵，谢谢啊，这是不是就是所谓的包子啊？这钱怎么花呀？
邮件联系哈
适合做稳定转染，能否把CMV切掉换成其他启动子呢？ |
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b******k
发帖数: 1874 | 28 gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter |
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B******o
发帖数: 496 | 29 你说的plasmid转染还是病毒感染？
lentivirus从感染细胞到整合到基因组到表达蛋白都需要时间
你能给个24时就能看的reference么？
俺先给俺的吧。System biosciences的protocol明确写了3天。Openbiosystems明确写
的2天。自己的经历也是至少2天。无论是CMV,PGK,or MMLV promoter。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 30 我试着在protein前面加了pFLAG-CMV-1的preprotrypsin leader sequence,
protein后面有6HIS tag.
transfect 到293T 里后，收media和lysate
直接跑western:lysate里面看到了，但是Media里没看到
Purify by Ni column,lysate和media里都没看到……
想请问一下大家如果想让蛋白分泌到media里，是如何做到的？ |
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j******i
发帖数: 939 | 31 Thank you for comments! I do have CMV promotor before my gene and the
construct will be used to express in mammalian cell line. Yes, you guys are
right. Without Kozak sequence, it looks like all depends on lucky to get
high expression. To be safe, I'd better add it back to my constructs. It's
painful and a lesson I learned--to be more careful before I start an exp. |
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z****g
发帖数: 3340 | 32 想要一个表达vector pCDH-CMV-puro/copGFP能否分享一下，可站内交流。 |
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a********p
发帖数: 94 | 33 在Hela之类的比较好养的细胞中表达一个酶，用CMV之类的质粒，如果wt中有这个酶的
表达，但是
不高，那么转染筛选之后能得到一个比较高的表达么，比如10fold或者100fold higher
？ 还是说
这个问题要具体情况具体分析，如果这个酶的高表达对细胞生长或者生存不利，那么很
可能就得不
到比较高表达的细胞株？
新手诚心请教 |
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y****6
发帖数: 196 | 34 use CMV promoter. Large volume (in 1.8-2 ml saline). Inject as fast as
possible (finish in 2-3 seconds). |
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w*********e
发帖数: 98 | 35 我前段时间刚遇到过同样的问题。换成CMV promoter的renilla 会好很多。个人认为
我们研究的蛋白对TK promoter 有一定的特异激活作用。希望对你有帮助。 |
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y****6
发帖数: 196 | 36 Use CMV-gal as control. |
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q**********0
发帖数: 335 | 37 谢谢以上各位的回复。我也正想用CMV-Reilla试试，希望它不受目的蛋白的影响。
我们转染的目的蛋白和报告基因都是瞬时表达体系，不会整合进宿主基因。所以变异可
能还来自实验系统本身。对于稳定转染的细胞系，是否转染的目的蛋白和报告基因已经
丢失掉？ |
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