j******i
发帖数: 939 | 1 -6, -3 plus +4 are most important positions. In your case(+4 is not G ), so
put GCCACC(which is consensus sequence among vertebrates) before the start
codon theoretically should be more optimal than just CACC. |
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j****x
发帖数: 1704 | 2
一般设计KO的时候都会考虑这个因素，不大可能保留truncated protein的表达，一般
就是无关序列很快有stop codon终止。
目前对于一般商业化的chip，如果出现你说的这种非特异性，这个芯片基本也就不要卖
了。 |
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H*********8
发帖数: 323 | 3 谢谢楼上的回答, 是转mammalian cell, lipofectmin ltx
试过,转商业性的质粒,在我细胞系里能达到80-90%,但转我的BAC, 不WORK.
do you know whether the promoter of your gene is activated in the target
cells?
这位兄弟问得好,我在做之前就RT-PCR过了,表达.而且在这个细胞系里表达应该不弱,这
是肯定的.
我最终要做转基因老鼠,但做之前我需要确定这个BAC做得没问题,所以先在体外用细胞
系做.
这个BAC的构建方式是这样的,携带着整个A基因的BAC, 在第一个外显子处插入CRE基因,
把本身A基因的ATG突变掉,关键我老板设计的时候,CRE只有STOP CODON, 但没有PLOY A,
然后就这么插进第一个外显子里了. 我不知道算融合蛋白,还是到CRE终止子这儿就停
止翻译呢? 这样设计是否影响CRE的功能?
所以在做转基因老鼠之前,我得看看是不是WORK.
请有经验的人给指导指导. |
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H*********8
发帖数: 323 | 4 我这个BAC的构建方式是这样的,携带着整个A基因的BAC, 在第一个外显子处插入CRE基
因,
把本身A基因的启动子ATG突变掉, 我老板设计的时候,CRE只有STOP CODON, 但没有PLOY
A,
然后就这么插进第一个外显子里了. 我想问问这样 能不能终止cre的翻译。这样得到的
蛋白算A基因和cre的融合蛋白,还是只
表达CRE，是否影响cre的功能？
请有经验的同仁帮个忙，解答一下。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 5 如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，也会造成移码（66％可能性）
或表达不完全。算作第E种可能性吧。
最简单的办法就是，把Cre放在后面的外显子里，可以用2A或IRES表达一个完整
的Cre蛋白，如果你不喜欢融合蛋白的话。分析原因毕竟不是你自己的课题。
愿你好运。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 6 从你的描述来看，你说能够检测到Cre mRNA（如果你的RT-PCR没有DNA的污染），
说明mRNA的转录没有问题（不知道是不是测的full-length)。如果是这样，说明没有
Cre 表达的确是蛋白翻译的问题。
不是所有的mRNA的ORF的ATG都有标准的Kozak结构，所以我说是Kozak或是类似
的结构能够让ATG做翻译起始密码子。有许多的基因的mRNA, 在其ORF的起始密码子
前面还会有一个或多个ATG，但它们并不是start codon。所以说核糖体结合mRNA后
遇到的第一个ATG并不一定是起始密码子。除了所谓的标准Kozak序列之外，肯定还
有其它机制让一个ATG成为起始密码子。这只不过是我自己的一点个人经验。十有八九
是错的。也希望别人能够回答。谢谢。
因为实在有点忙，所以可能不能及时回答您更多的问题了。抱歉。
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v***a
发帖数: 1242 | 7 昨天重新测序了，全对。不过stop codon “TAA”的最后一个“A”未测出来，这个应
该不要紧吧？我的细胞是primary cells，我把plasmid转染进细胞，进行transient
overexpression。
primer |
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T*****n
发帖数: 274 | 8 其实也要视实际情况。比如knock out target gene的一个exon by introducing
frameshift and stop codon (对于很多很大的基因来说，这样做很常见），如果
RT－PCR的一条引物在敲掉区域，肯定是检测不到mRNA的；但实际上target
gene有可能表达为truncated/mutated form，这样子的话RT-PCR就会出错。
这种情况下，RT-PCR引物扩增没有delete的片段更加可靠,它可以明确告诉你target
gene是否有表达为任何形式。
当然，最可靠的手段还是southern和western。 |
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g***y
发帖数: 201 | 9 1. A lot of expression vectors contain SV40 pA or BGH pA. You can simply
PCR adding those sequence right after the stop codon.
2. It all depends on how you design your KI allele. If your KI allele is
only to replace one exon, then you don't need to worry about anything. If
you are to insert a cDNA sequence right at the 1st exon,
then you may have to worry about non-sense mediated dacay. In this case, it
would be safer to add an exogenous pA.
allelle |
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s******s
发帖数: 699 | 10 要表达GST融合蛋白，第一次转进BL21 codon+（找别人借的...）中，挑菌，摇过夜，
存了一份glycerol stock放在－80, 然后剩下的菌IPTG诱导,成功表达。
可是后来用glycerol stock, 同样的条件，却再也不能诱导表达了，我也从冻在四度的
板子上再挑过菌，还是不能表达。
现在的打算是再找别人借一次（主要是有六个蛋白要表达一老借也不是个事），但还是
觉得很奇怪，菌的抗性还保存着说明质粒应该还在啊，当然这个菌不是保存质粒的好选
择，会有重组，可我还是不敢相信六个样品都发生重组。
有人知道这种第一次可以表达第二次就不行的现象是为什么吗？先谢谢大家了。
下面是抱怨帖：博士后天天在后面追着要蛋白，可是我还有ACE马上要过以及自己的课
题还有别的一堆事，真的没有那么多时间来trouble shooting啊>_< |
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s******s
发帖数: 699 | 11 谢谢谢谢，看来不是只有我一个人碰到过这个问题。
我要来了这种菌，不过这个codon＋里面自带质粒所以有三种抗性，有两种抗生素我们
没有所以要买（如果只用一种抗生素的话可能回掉质粒），所以先上来问问有没有人知
道为什么会有不表达的情况在决定是借菌还是买抗生素。
实在太谢谢您了～ |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 我没做过。不过比如nucleosome depletion, polII binding， histone marks, etc |
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q*****n
发帖数: 331 | 16 我敢说这个版上大部分人，包括我，不认识蘑菇。却都知道 ATG是 Start Codon。 不
能不说是种悲哀。学了一堆高射炮的东西，跟生活完全脱节。 |
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c********b
发帖数: 363 | 17 actin是我的一个control所以没有花太多时间去研究。
我也是很痛苦提蛋白才摸索出这个方法的。我主要研究的蛋白是很经典的一个蛋白，表
达很难。我用的植物的基因因为codon bias就更难了。
我知道这个法子可能可以发个小methods，身边朋友试过也都告诉过我，无奈现在老板
没有兴趣，自己独立遥遥无期，加上实验室以前就没有做过蛋白生化，我也只是半路出
家的半吊子，这样投比较麻烦。再说一篇technical的小文章不会有太大用，自己也不想
花太多精力所以昨天犹豫了一下也就把方法贴出来了，能对研究有用才是最终目的。：）
最后说一下，蛋白还是很复杂，所以大家可以尝试一下。大多数情况应该是OK的，但是
肯定有不适用的，那就只能再摸索了。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 this only mean it containing a full ORF,
If you want confirm it, make sure the stop codon before ATG,
And do comparison between species. |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 as the file attached by LZ,assuming the KI sequence contain a stop codon,
there would be at least 3 EJC not removed to recruit NMD.
were
the
conditional |
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C*****h
发帖数: 926 | 21 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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C*****h
发帖数: 926 | 22 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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p******i
发帖数: 1092 | 23 PAT PAT
是不是因为你和其他2个LAB KO掉的GENE部位不一样？
因为mouse gene一般都很长啊，搞不好有什么alternative Transcription start site
或者alternative start codon啥的。没把这些alternative的敲干净，KO里面表达个
truncated也能凑活着用，就看不见表型了……
其实，就算全敲掉了，也不一定放心：万一有个啥miRNA正好也被敲掉了然后影响到其
他一坨GENE……
说到底，还是生物太复杂了…… |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
测）
一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
1。放kozak sequence,
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon. |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 Kozak sequence 的确就是和你的蛋白的ATG 融合在一起的。
Kozak sequence 之前的stop codon 可以保证前面的序列如果不小心导致了蛋白
翻译到了那里肯定会被切断而不会干扰你后面的序列 |
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l******g
发帖数: 1145 | 26 多谢neverthink的建议，在这些事情上我真是太笨了！我会认真考虑你的建议的。
其实V不是个坏人，他对我还不错，这次我纯属“城门失火、殃及池鱼”的那条池
鱼= =
但眼下这事上他真是偏心偏太厉害了，连我老板其实都看不太下去了。
其实有些事情我还没说，K一开始参与进来时，要克隆个质粒，因为分子是我的本行，
我老板就让我帮他的忙。他挺怕我抢功劳，图谱不给我看、思路都不和我商量，就设计
好克隆方案，让我帮他打下手。
结果他设计时候就错了，犯了个stop codon都没删掉就连个东西在后面的低级错误（类
似错误犯了好几次，我真服了他了）。然后质粒不work后，他就试图把责任推到我身上
。天地良心，你让我怎么切怎么连，我全都照你说的做了。
还好我留了个心眼，因为我老板做分子出身的，所以有啥动向我一直及时向她汇报，所
以她帮我挡了下来。经过这件事，她也多少知道K的为人。
其实正是因为这些过节，我特别不待见K，想到是被他抢文章，实在咽不下这口气。
我真想学学他给老板灌迷魂汤的本事啊！
C真是个超nice的人啊，和他合作一直很愉快，也很尊重人。但V一直想赶他走。
有次和V的学生一起搭他的车，路上聊... 阅读全帖 |
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L*******e
发帖数: 2153 | 27 in frame?
or after you cloned in, you generated a protease cleavage site or a stop codon? i would
sequence it first, then BLAST the linker sequence to see what comes up. |
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H******d
发帖数: 13 | 28 谢谢您提供的建议！构建经过测序确认，而且在RNA水平上也确认正确，不存在您
提到的这两种可能性，另外用抗体能检测融合蛋白表达。
codon? i would |
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n******7
发帖数: 12463 | 29 情况大概是这样：我们做了很多cDNA clone，测序之后选取了一些进行了下游的实验，
主要是in vitro 的protein实验。我们鉴定了很多新的splicing isoform，其中有不少
有premature stop codon(可以是splicing 造成的，也可以使indel造成的）
现在我们想做一些quality control，去掉一些不靠谱的transcripts，于是出现了分歧
组里的大姐想法是要尽量跟已知的protein一致。把每条isoform对应的protein align
到已有的protein sequence上。如果整条protein基本align上去，即便使truncated
protein, 不管什么原因，都可以作为partial protein 保留。但是如果shifted frame
的amino acid sequence长到一定程度，那就认为这些protein sequence跟已有的
sequence太不一样，要除去
我完全明白大姐为什么那么想，因为我们实际test的是一些protein sequences
但是就我这部分工作，我需要关... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 30 if your target mRNA its 3' UTR super long (over several kp) tor before the stop codon high GC rich region
then you can only get with normal qRTPCR then PCR whole 3RACE PCR products.
This case please try another method:
: ligation-anchored PCR cloning
一句话就是用内切酶对应的人工引物锚定: 3'端 做人工锚定引物PCR
mRNA with a primer (3'-poly
(dT)17 with an anchor sequence at its 5'end, then qRTPCR then PCR sub cloning... sequencing.
References:
//genome.cshlp.org/content/4/1/19.full.pdf
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles... 阅读全帖 |
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g******a
发帖数: 63 | 31 最近在做Chromatin IP, 以前都做转录因子结合DNA，一般先做个预测，然后蛋白拉
下来做pcr。老板说想看下转录因子结合后，组蛋白在该基因启动子区域结合的变化。
我想请教一下组蛋白结合在DNA启动子上的什么区域，好方便设计引物？是ATG
start codon附近还是TATA box之类的呢？
另外，如果我选一个促进的，一个抑制的组蛋白，可以选H3K9Ac和H3K9Me2/
H3K27Me2的antibody吗？
以前没有做过组蛋白的问题，请熟手不吝赐教，感激不尽。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 32 下面第二句，为什么这是个advantage? 看起来非常糟糕啊，说明在488和550左右都能
被激发
或者blue laser和green laser有别的意思？
DsRed-Express2 has additional advantages. It is excited efficiently
by both blue and green lasers that are routinely used in
flow cytometers. In bacteria, DsRed-Express2 is expressed from the
endogenous start codon much more strongly than DsRed-Express
(Supplementary Fig. 4). Another important property is phototoxicity,
which has only rarely been measured for engineered
fluorescent proteins. Our results indicate th... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 33 新手上路，可能问题对各位比较简单~
先谢谢了
我现在的目的蛋白在质粒里，有stop codon，接下来有两个目的
1）在N- & C-terminal 加各种tag，50a.a左右
2）把蛋白克隆到lentivirus里去
请问各位最好的流程是怎样的，现在各种纠结啊～
谢谢大家 |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 基本上算是定论了。
目前的大部分基因分析结果都支持这个说法
因为线粒体内部的ribosome RNA 还有 codon usage都接近古细菌，而和宿主的不一样。 |
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x**2
发帖数: 255 | 36 你要合成基因？
版上有人推荐过找公司合成
又便宜又省时 |
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s******s
发帖数: 13035 | 37 多便宜啊？
一点几k的基因，我是打算gblock三段，gibson assembly呢 |
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x**2
发帖数: 255 | 38 www.genewiz.com
1.6kb我拿到的报价是600美元 |
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s******s
发帖数: 13035 | 39 最后我还是找了genscript要了一个quote, 1.1kb的大概$400,和你
这个差不多。不过还是不如gblock便宜，我直接拿着genscript optimize
好的序列扔给idt了 |
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h**********r
发帖数: 671 | 40 Thanks! 做之前先是要看codon的，查查CAI。
就是不确定用啥颜色的。
我手上单独用得最多的就是gfp和dTomato。
多谢啊！
先发一个包子吧！ |
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b******y
发帖数: 627 | 41 If you have a 50 a.a peptide with no particular 2nd structure, I call it a
peptide. Some polypeptides, like ww domains, have only about 40 a.a. (3
short beta strands packed in an antiparallel fashion), which can bind
proline-rich peptide ligands. I can call them proteins or at least protein
domains. I believe there are a few domains that are of comparable size or
even smaller than ww domains. Don't remember what they are called on top of
my head.
As we all know, it is so trivial to translate DNA... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 3个不可以，最短必须要四个。
另外，如果你非要用site directed mutagenesis 的话，最好不要用完全一样的
his codon. |
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s******s
发帖数: 13035 | 43 genescript不错，codon optimization啥的quote的时候就给你发过来了 |
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R*Q
发帖数: 179 | 44 http://chou.med.harvard.edu/jameschou_CV.htm
Dr. James Chou
Education
1993 B.S. in Physics, University of Michigan, Ann Arbor
1994-1999 Ph.D. in Biophysics, Harvard University, Boston
Advisor: Professor Gerhard Wagner
46.
A formulation for correlating properties of peptides and its application to
predicting human immunodeficiency virus protease-cleavable sites in proteins.
Chou JJ.
Biopolymers. 1993 Sep;33(9):1405-14.
PMID: 8400033 [PubMed - indexed for MEDLINE]
Related citations
47.
The quin... 阅读全帖 |
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c**i
发帖数: 265 | 45 我在做一个RNA tethering assay in HEK293T，ORF1-stop codon- aptamer -KOZAK
-ORF2.
理论上ORF2蛋白是不应该表达，由于在终止密码子之后。但实验表明ORF2蛋白有表达，
并且表达量和转染的质粒量成线性关系。请问大家有没有这样的经验？十分感谢。 |
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g*******3
发帖数: 2520 | 46 想在中间加个酶切位点，应该没问题吧。我的理解不需要IRES序列后就非要直接跟GFP
的ATG start codon.不知道理解的对不对。急，请回答。 |
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m***o
发帖数: 272 | 47 做RACE，找到一个alternativesplicing form. 比如从intron5 转录了50bp接着exon6
直到stop codon。这个intron5也有splicing的标识。然后就设计了primer针对intron5
转录的这段做RTpcr，得到很亮的条带。偶尔发现用这个primer直接从genomic里也可以
得到PCR片断。怀疑假gene。但是我现在怎么能知道这个mRNA是splicing form呢，还是
直接从pseudogene转录的呢？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 Genomic strand:
5'----nnnn-----mmmm--- intron5--50bp----exon6-----nnnn----mmmm--Stop codon--
-UTR------3'
设计two 引物从 upstream of --intron5--50bp- at least not over lap over 6
nt base
from that 5'-end of intron5--50bp--
然后对于cDNA=(设计了primer针对intron5
semi-nested PCR 30 cycle, if no band that is alternative splicing form
if still had band and size is same to last (发现用这个primer直接从genomic里
也可以得到PCR片断) that is pseudogene.
exon6
intron5 |
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V*f
发帖数: 171 | 49 中间加个 IRES就可以表达两个基因了, 不需要去 stop codon |
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b******n
发帖数: 4225 | 50 你突变体纯合子能被抗体检测，是western还是免疫组化？
突变体纯合子的mRNA可以做primer extension，看看是不是有alternative start
codon
想降低qPCR本底水平，引物可以设计一端priming在exon1，另外一端在别的exon或者5'
-UTR |
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