o**d
发帖数: 3080 | 1 你做confocal用的isotype control是和做flow用的一样吗？
一般做flow都是先block FcR加封闭（我一般是一起做），再染色，所以我想做cofocal
应该也一样。
你说你的目的蛋白是胞内的，那么做flow的时候一定做了破膜，我对cofocal不是很了
解，但是你是否也应该增加膜的通透性？因为也用可能是你的antibody没有进到细胞内。
希望对你有帮助。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 2 这两个蛋白质都是氧化磷酸化链复合体III和V的亚基，位于内膜基质这一侧。外膜内膜
的蛋白质是cofocal无法区别，线粒体和ER有相连的膜，因此cofocal会有部分重叠。所
以无法证实这两个线粒体蛋白质是否和ER目标蛋白质相互作用。 |
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C*********y
发帖数: 2738 | 3 leica的相机没有用过，显微镜和cofocal用过，好阿。 |
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m*****j
发帖数: 144 | 4 本人女，一般美国大学PhD在读第三年了，专业是微生物。研究的课题是益生菌，就是
研究益生菌益生机理，平时的主要技术就是构造突变体，然后拿它做各种生物assay，
显微镜，荧光标记cofocal...HPLC, LC-MS,鱼类实验（我们实验室是研究鱼的益生菌的
）...
最近开始关注毕业找工作的事情，发现从monster上看到的绝大多数都是有关clinical
laboratory 或者food science（这俩一般招的是master,干manager的），再次就是生
物制药公司招scientist的或者manager(PhD or master)。
我们微生物系有两部分，一是以我老板为例，搞research science的；另外一个就是搞
clinical的，但是只有bs和ms，没有PhD.所以，我想我要不要利用这个条件（我们系开
设clinical的专业）再辅修一个ms in clinical呢？但是一想，老板肯定不愿意，我多
选一门课，他都说：没用，你好好做实验就行了。或者，我可以背着他自己偷着考个
clinical license?（貌似不靠谱，需要课程学分才能考，对不？... 阅读全帖 |
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m*****j
发帖数: 144 | 5 本人女，一般美国大学PhD在读第三年了，专业是微生物。研究的课题是益生菌，就是
研究益生菌益生机理，平时的主要技术就是构造突变体，然后拿它做各种生物assay，
显微镜，荧光标记cofocal...HPLC, LC-MS,鱼类实验（我们实验室是研究鱼的益生菌的
）...
最近开始关注毕业找工作的事情，发现从monster上看到的绝大多数都是有关clinical
laboratory 或者food science（这俩一般招的是master,干manager的），再次就是生
物制药公司招scientist的或者manager(PhD or master)。
我们微生物系有两部分，一是以我老板为例，搞research science的；另外一个就是搞
clinical的，但是只有bs和ms，没有PhD.所以，我想我要不要利用这个条件（我们系开
设clinical的专业）再辅修一个ms in clinical呢？但是一想，老板肯定不愿意，我多
选一门课，他都说：没用，你好好做实验就行了。或者，我可以背着他自己偷着考个
clinical license?（貌似不靠谱，需要课程学分才能考，对不？... 阅读全帖 |
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w******y
发帖数: 2504 | 6 染LIVE CELL的MIT和LYSO，请问染完了以后需要固定了再看COFOCAL么？还是不能固定
。 |
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b******s
发帖数: 5365 | 7 从来没有做过B cell,现在要在B cell line里看一个细胞内蛋白,用一样的抗体,flow
cytometry没问题但做cofocal isotype control 的背景很强.目前为止blocking 效果
最好的就是老鼠血清(用的抗体是monoclonal mouse antibody directly conjugated
with Alexa Fluor),但问题是背景没了,信号也弱了好多.这个实验组和isocontrol 比
起来亮不了多少.现在打算用1抗加2抗做,一般是用和二抗同种的血清来做blocking,但
听之前染过这个蛋白的人说,二抗血清对B cell Fc没什么作用.我的问题如下:
1. 不知道这种情况下能不能先做Fc blocking再用二抗血清block?
2.Caltac Laboratories (now belong to Invitrogen)原来有个抗CD32,但不连接荧光
素的已经不卖了,而且那个也是从老鼠养出来的.请问有什么非老鼠的抗体或血清适合做
human B cell FcR blocking?
3. 做co-staining 的... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 5365 | 8 用的抗体和isotype都是和flow一样的.做confocal 时先用4%PFA fix然后用0.1%
triton-X100 permeablize.应该不是通透性的问题,因为我同时染了另一个细胞内蛋白,
那个的染色信号就很好.
请问你用什么做block FcR?你说一起做,是不是指把block FcR的 reagent 和二抗血清
混合一起孵?谢谢!
cofocal
内。 |
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o**d
发帖数: 3080 | 9 我一直都是做鼠Bcell的flow，而且基本上直标的抗体。而且我们实验室用的FcRblock
是自己养的单抗上清。
看了你的描述，是不是可能用4％PFA固定的时候把抗原给破坏了？如果可能的话，试一
下你做flow用的fix－permeblize buffer和条件来做cofocal。
祝好运。
白, |
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T*****u
发帖数: 3257 | 10 希望表达在cytoplasm. 分crude membrane and cytosolic fraction发现在membrane
fraction里面。用cofocal看却看到在 everywhere。怎么回事？ |
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i***l
发帖数: 1656 | 11 分crude membrane and cytosolic fraction, how crude? sure 100% seperated by
centrifugation?
用cofocal看却看到在 everywhere, marker? plasma- membrane and introcellular
vesicle markers? |
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