m**********3
发帖数: 706 | 1 I am doing a coIP (use a mouse antibody to pull down and use a rabbit
antibody for IB) and found my band
overlap with a rabbit IgG band. Any reccomendation for a good secondary
without IgG band or coIP? |
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s*****t
发帖数: 107 | 2 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子 |
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s*****t
发帖数: 107 | 3 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子 |
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y****u
发帖数: 1 | 4 最近开始做3t3l1的ip，但是由于lysate里面脂类太多，ip sample 的目标条带总是比
世纪mw大，而且条带比较弥散，不知道版上有谁有比较多3T3l1 ip经验可以分享一下？
wb我用lammeli buffer裂解所以没有脂类污染的问题，但coip没办法用这么harsh的裂
解液。 |
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W****7
发帖数: 426 | 5 不管什么裂解液，多离心几次取下面的清亮的部分，彻底去掉脂肪部分。话说回来，有
一点也不会影响你的coip的。 |
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W****7
发帖数: 426 | 6 不管什么裂解液，多离心几次取下面的清亮的部分，彻底去掉脂肪部分。话说回来，有
一点也不会影响你的coip的。 |
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x*********n
发帖数: 43 | 7 Do you have any protocol of coIP from chloroplast? I could not find one to
use.
Thanks very much |
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l********s
发帖数: 70 | 8 我做CoIP， IP检测的蛋白size 和IgG size 刚好都是50kd 怎么办？？
谢谢大家了！ |
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发帖数: 1 | 9 我只是做过很多tail anchored protein，有一些经验。
我觉得你说的已经可以充分证明作用区域在TMD。如果现在设想的单纯用TMD的办法又表
达量很低，那么可以考虑swap TMD。就是找另一个在细胞膜上毫不相干的跨膜蛋白质，
挑它的TMD，就找中间20个非常疏水的AA应该没有问题，swap到你蛋白质里，然后做
CoIP。这个不相干的蛋白质作为negative control。这样可以保证你的蛋白质TMD外围
信号不变。
但是要提醒你，如果蛋白A和蛋白B都是跨膜蛋白，CoIP出来的结果可能是假阳性，特别
是你用的detergent只有NP40，并且negative control是cytoplasmic protein，比如
free GFP。那么AB会CoIP，negative control不会。因为NP40是弱detergent，我怀疑
membrane在buffer里被打成了micelle， 所以AB同在micelle里一起被IP。如果用RIPA
buffer你会发现AB不CoIP了，当然你也可以认为RIPA buffer太强了。所以除了CoIP最
好有其他证据证... 阅读全帖 |
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b****u
发帖数: 903 | 10 在revision，review建议endogenous的coip检验是否binding，表明真实的相互作用状态，我们文章里面，overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有成功，以前就看相关文献，一篇cell里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连overexpression这2个蛋白，我们也没检测到binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。 |
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n*********s
发帖数: 552 | 11 嗯，这个很中肯。老板是非常聪明的人，可是在我自己的project这个领域他也就只有
gerneral的智慧，路子全要靠我自己摸索。实验室除我以外所有的人整天玩儿coIP之类
的，我一看这个就头大，喜欢搞点动物模型，找到表型然后挖机理，无奈走的异常艰难
，还没什么人可交流。每次看到老板饶有兴趣的跟组里其他人抠coIP图上的条带是不是
有变化就觉得非常frustrating，忍不住心里说一句who cares？！非天才级选手确实也
不够踏实～ |
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x********e
发帖数: 35261 | 12 没做过，从理论上说说我的思路。
ChIP拿到的是所有可能结合蛋白A的DNA。coIP拿到的是所有可能结合蛋白A的蛋白。你要
限制在特定promoter的话要用DNA pull down protein去打质谱，然后用coIP去证实pro
tein complex里的成员。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 13 有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的target
。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋白/
DNA之间有无关联。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 14 当然的有control啊，或者pre-clear,或者搞个competition什么的
：有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的
target
：。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋
白/DNA之间有无关联。 |
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发帖数: 1 | 15 多谢回复
我是真核里慢病毒稳转
蛋白是一次跨膜蛋白
做coIP验证相会作用位点的
胞外和胞内区域都拉不出
后来分别加上跨膜区 就都能拉出来了
所以我想单独做一个跨膜区表达 做coip
想证明是跨膜区相互作用的
看作用强弱 所以表达量应该还是要有的吧
我可能比较傻了 以为跨膜单独拎出来就行
不知道您的建议是如何？
感觉阁下经验很丰富 大谢 期盼建议 |
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s*****b
发帖数: 4115 | 16 更换intake manifold后出现的问题
1）发动车子，P档时，没有任何异常；从P档换成D档，如果踩住刹车不动，便会有节奏
的颤动；松开刹车前行，没感觉到什么抖动（也许有、只不过不明显）；
2）踩油门加速时，车子也会明显抖动。
check engine light不亮，所以也没法去autozone读code。
网上查过可能的问题很多，比如火花塞/点火线圈系统、喷油嘴、节气门洁净度/sensor问题、vacuum line等密封问题。自己一个个排查也许也能找出原因来，不过鉴于动手能力不强，怕造成新的问题，就寄希望于高手能指点一下迷津。
如果检查某个缸失火的话，是不是只要拔下该缸的点火线圈（coip系统）放到一边，再点火观察，就可以了？
另外更换intake manifold时拆下了windshield下面的塑料支架，现在感觉那个支架和玻璃之间贴得不紧，是不是需要买什么胶密封一下？ |
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e*****t
发帖数: 110 | 17 小女国内一流大学毕业，有医学、生物背景，但是不能考版。10年+bench work经验，
掌握的技术很多。分子生物，细胞，细菌，慢病毒，小鼠大鼠动物模型，FACs，ELISA
，qpcr，免疫荧光染色、组化、WB，IP，coIP，EMSA,RIA等等。因第一个老板做的方向
不是很对口，磨绿卡没换地方，现在对做PI没了信心和资历，因lg要来boston读书，想
找个技术员的职位。
本人工作效率比较高，不喜欢没事在实验室耗（家有上学的小孩，也耗不起）。现在的
工作量差不多平均每天能跑6-8张WB外加其他实验。不需VISA，有绿卡
有兴趣的请站内联系，我可以给你发CV和ref。 |
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h********3
发帖数: 5 | 18 安必奇生物科技有限公司
公司简介
北京安必奇生物科技有限公司成立于2006年，是由一批资深留学归国人员创办的研发服
务公司，主要从事基因工程药物，尤其是单克隆抗体药物的基础研究、应用研究。2015
年被科技部评为“高新技术企业”。随着公司的发展和越来越多的优秀人才的加入，逐
渐发展成为了全球领先的以制药、生物技术开发等一系列全方位的实验室研发和研究生
产为主的制药公司，服务范围贯穿从药物发现到实现生产的全过程。公司依托深厚的国
际资源背景、经验丰富的留美科研人员致力于通过高性价比、高效率的研发服务帮助全
球客户缩短药物研发周期、降低研发成本。
安必奇国际化的科研团队，以研究为首任，以客户为中心，凭借一流的技术平台，丰富
的科研经历，已与多个国际知名药企合作开发项目，公司在生物新药研究开发领域有着
深厚的工作积累，在全世界范围内构筑了良好的合作关系。核心团队来自国内外著名高
校如：University of California，Los Angeles、State University of New York、
Arizona State University、école polytec... 阅读全帖 |
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e*****t
发帖数: 110 | 19 小女国内一流大学毕业，有医学、生物背景，但是不能考版。10年+bench work经验，
掌握的技术很多。分子生物，细胞，细菌，慢病毒，小鼠大鼠动物模型，FACs，ELISA
，qpcr，免疫荧光染色、组化、WB，IP，coIP，EMSA,RIA等等。因第一个老板做的方向
不是很对口，磨绿卡没换地方，现在对做PI没了信心和资历，因lg要来boston读书，想
找个技术员的职位。
本人工作效率比较高，不喜欢没事在实验室耗（家有上学的小孩，也耗不起）。现在的
工作量差不多平均每天能跑6-8张WB外加其他实验。不需VISA，有绿卡
希望老板不要太变态就行了，reasonable pushy一点没关系。
请有相关信息的bostoners站内短我，比如知道哪个老板想招人啥的，多谢！ |
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p*******e
发帖数: 1167 | 20 【 以下文字转载自 Music 讨论区 】
发信人: Loveless (CoIP熟练工), 信区: Music
标 题: Re: Loveless日语翻唱：流星花园1插入歌－星象仪
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Feb 5 22:05:51 2007)
歌词：
夕月夜 顔だす 消えてく 子供の声
遠く遠く この空のどこかに 君はいるんだろう
夏の終わりに2人で抜け出した この公園で見つけた
あの星座 何だか 覚えてる
会えなくても 記憶をたどって 同じ幸せを見たいんだ
あの香りとともに 花火がぱっと開く
行きたいよ 君のところへ 今すぐ かけだして 行きたいよ
まっ暗で何も 見えない 怖くても大丈夫
数えきれない星空が 今もずっと ここにあるんだよ
泣かないよ 昔 君と見た きれいな空だったから
あの道まで 響く 靴の音が耳に残る
大きな 自分の影を 見つめて 想うのでしょう
ちっとも 変わらないはずなのに せつない気持ちふくらんでく
どんなに想ったって 君は もういない
行きたいよ 君のそばに 小さくても小さくても
1番に 君が好きだよ 強くいられる
願いを 流れ星 |
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c*********t
发帖数: 340 | 22 如果想证明A和B相互作用，在CELL LINE里表达FLAG epitope-tagged A
然后证明B也能一起被PULL DOWN
这个方法有什么缺点吗（我觉得这种大量表达某种蛋白可能会造成某些ARTEFACT？）
为什么要用FLAG TAGGED A呢
直接拿cell lysate做CoIP为什么不行呀
请达人指点下，多谢！：） |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 I am a little bit confused.
Why don't you use protein A/G to do the pulldown?
Why do you want to use 2nd ab for pulldown? |
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n******d
发帖数: 1055 | 25 stop doing IP. that is the solution. |
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s***a
发帖数: 671 | 26 如果你说的是heavy chain band 干扰的话，可以尝试light chain specific的二抗。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 28 我转染的时候细胞密度有点低，
转染之后细胞又生长很慢。
现在已经快72个小时了，
还能让细胞再生长么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 If your plasmid has SV40 replicate sites and if the expression doesn't kill
the 293T cells, then I think you can grow them for a week or more. |
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o**4
发帖数: 35028 | 30 No SV40 replicate sites
kill |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 Then you can only keep them for up to the double number of cells
In most case it only take one day for the 293T cell to grow to double number.
In your particular case you will have to judge by yourself |
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o**4
发帖数: 35028 | 32 It works for me in 2 or 3 days.
I just don't know whether it works more than 3 days.
Anyway, thanks a lot.
number. |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 The critical things is the plasmid without a SV40 replica site will
not be replicated in 293T cell and therefore will be "diluted"
after each cell passage.
Usually the thumb of rules are keeping the transfected cell of at
least 10% of the total cells.
293T cells are usually very easy to transfect so we can assume 90%
are transfected in the begining. However if the transfection of your protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow the transfected ones in a few days. As |
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o**4
发帖数: 35028 | 34 Oh,I see
It's very good to know this.
Thanks again
protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow
the transfected ones in a few days. Assuming the 293T cells replicate every
24 hours, then in three days, the 10% untransfected cells will become 8
times of their original number and therefore will reach almost 80% of the
total cell population. |
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R*****w
发帖数: 447 | 37 学习了，
请问怎么知道plasmid 是否有SV40 replica site? pcDNA3.1 有SV40 replica site吗？
protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow
the transfected ones in a few days. Assuming the 293T cells replicate every
24 hours, then in three days, the 10% untransfected cells will become 8
times of their original number and therefore will reach almost 80% of the
total cell population. |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 看一下vector map或者说明书，上面有的。
要知道这个sv40怎么来的不妨自己google 一下
并不是每一种细胞都有这个功能的，293T 细胞是因为被某种病毒感染了所以才有
这种功能
我刚才给他算的那个答案是针对他的具体情况算的。对于别的情况要修改一下
算法.
不过一般来讲是不应该超过3天。
吗？
every |
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R*****w
发帖数: 447 | 39 Thank you very much, sunnyday!
I figured it out and found that pcDNA3.1 does have sv40 origin.
The following is some information from Wiki, in case someone else is
interested in this:
HEK 293 cells were generated in early 70s by transformation of cultures of
normal human embryonic kidney cells with sheared adenovirus 5 DNA in Alex
Van der Eb's laboratory in Leiden, Holland.
An important variant of HEK293 cell line is the 293T cell line that contains
, in addition, the SV40 Large T-antigen, that |
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C***Y
发帖数: 61 | 40
状态，我们文章里面，
overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有
成功，以前就看相关文献，一篇cell
里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连
overexpression这2个蛋白，我们也没检测到
binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。
Hopefully these tips will be helpful.
Make sue you have a very good 1st antibody. A strong antibody is capable of
pulling down weak interaction
partners.
Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from beads
after washing (instead of boiling
beads) to reduce background.
Use ECL plu |
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b****u
发帖数: 903 | 41 多谢各位的建议，crosslink我也曾经try过，就是重复不了别人的实验，人家内源也可
以pulldown，咱们overexpressing都不行，差距那叫一个大啊。
BTW，可能不同lab做COIP的时候的buffer条件不一样吧。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 42 我用promega的表达了一个质粒 用抗体可以检测到了， 但是貌似量很低 要用强的ECL
才能测到， 我还是担心做IP的时候量不够 会被洗掉。
另外做coip的时候是把两个质粒一起放进去表达好， 还是单独表达再混起来好呢？ |
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C******r
发帖数: 790 | 43 我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 44 走学术界还是fellowship好吧，比如NRSA之类，你也算是PI啊，而且是可以自己带走钱
带走project
工业界或者回国骗钱，可能coIP听起来有吸引力？ |
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w**t
发帖数: 52 | 45 Review了快2个月的文章，两个reviewer都只说到要补一个很容易做到的coIP，结果
Editer直接给拒了。早知如此，当初就
不该偷懒了……
被拒，悲剧啊。
这是我第一次投稿，请教一下各位有经验人士，editer 说补了实验再投算re-
submition。那还会找回原来的reviewer么？
审稿的进程会快一点么？谢谢～～～ |
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c******r
发帖数: 3778 | 46 sure，师姐说得对啊。但是colocalization是充分非必要的。所以算supportive
evidence。
一个 一个coIP吧，最直接证据 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 47 me too, rather 10 coips than one chip... |
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g*********5
发帖数: 2533 | 48 me too, rather 10 coips than one chip... |
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