K****a
发帖数: 161 | 1 你要是担心抗体被elute，你可以把抗体和beads crosslink在一起
lane |
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s******9
发帖数: 283 | 2 主要靠做proteomics吧。
比如把小分子radiolabel，做protein array，或者把小分子带上crosslinker和tag，
做mass spec。都是有风险的做法。 |
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T****i
发帖数: 15191 | 3 PFA crosslinking火候不好掌握。不过以前看人做过。能做好的都是牛人啊。 |
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j******n
发帖数: 941 | 4 RNA protection assay.
Crosslink, then RNase digest, then qPCR or other |
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a***e
发帖数: 1010 | 5 crosslink,
IP,
+/- RNaseA/T1
purify nucleic acid
p32 labeling,
PAGE |
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z**b
发帖数: 192 | 6 感谢回帖。我要的是纯化总的DNA-protein complex（上面crosslink的蛋白不能去除，
不能变性）, 需要将酶和反应buffer里的成分都去除干净，还要求recovery的百分比较
高，方法简单易行。望不吝赐教。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 7 Did you load the entire volume or you just load a portion? I can't say for
Chip but when I did regular IP I used a small volume and loaded all onto the
gels and this would tell me how efficient my IP works. |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 right now my problem seems to not be about ip but rather westernblot on
cross linked sample . my input did not work as well. |
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f**u
发帖数: 346 | 10 有点不明白你说的(2)。这个直接去跑的话那不是等于在跑完整的chromatin，这么大一
团东西怎么跑？ |
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d****7
发帖数: 109 | 11 对，完整的chromatin是一大坨，但是加了sample buffer，煮了之后，就不是了
跑起来没问题 |
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D***a
发帖数: 516 | 13 周末没上来看。
你这个怎么证明？之后做western？可是蛋白都被crosslink了。 |
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g****0
发帖数: 425 | 14 搭车问一下，myc （9E10）antibody crosslink后能pull down吗？
求protocol。 |
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M********a
发帖数: 35 | 15 大部分的TF binding site都是在nucleosome free region,也就是DnaseI HS sites，
但是如果chromatin没有solublize好，因为crosslink和sonication的bias,会导致
input也出现DnaseI HS的pattern,甚至有一种方法就是用这个原理去identify HS
sites的。一般ChIP protocol用150mM的盐，但是最好是300mM,盐浓度太低会导致
chromatin溶解不了。 |
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M********a
发帖数: 35 | 16 FAIRE，还有一个sono-seq也很类似。
我觉得如果你没有input的话就比较悬，至少igG control得有，不然的话哪些是false
positive很难说清楚，到时候reviewer估计也会问。
因为每次试验的条件会有些差别，比如reverse crosslink的时间，所以input的
variability其实差别还是挺大的。Control真的很重要。 |
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M********a
发帖数: 35 | 17 make sense
我觉得encode如果有标准的workflow,input质量还不错，加上去掉blacklist,那不
normalize也就算了，但是如果一般的lab,尤其是没经验的，意识不到crosslinking 和
sonication对input的影响，如果没做好，弄出一堆bias,又不normalize,岂不是结果都
不可靠了。。我没有仔细研究过，但愿如你所说，bias导致的peak值都比较小。我见过
normalize之后log2的值是0.4的，作者还claim enrichment。。。
peak
cound
strong |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 I too am actually a newbie so would greatly appreciate someone with more
advanced knowledge to join this topic.
My understanding is that once you are convinced that your antibody works
well, such as it can pull down the protein of your interest after extensive
crosslinking, it became easier for you to trust the pattern you obtained in
your sample.
And if you ever did, what is the amount of the target TF you can pull down
in the tissue of your interest? is it very abundant?
For most companies ChI... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 ChIP里面也有de-crosslink，试一下这些条件？
permeablization
? |
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s*******s
发帖数: 623 | 20 看到有不少人用Stratalinker 1800 UV Crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA).
请多指教，谢谢！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 21 我没用过，了解一点点。
我猜他指的是基于Crosslinking的Lable transfer方法。你Google一下就能找到。这个
方法并不能回答LZ的Stoichiometric ratio的问题。可能，细胞里测PPI有些优势。
in |
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h*********y
发帖数: 79 | 22 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
(1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
(2). microscale thermophoresis
没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
牛人帮我介绍一下？
(3). NMR
蛋白分子量太大。。。
(4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
-MALS)
从本人实验来看，蛋白A为10KD，配体B蛋白120KD，该方法测定的分子量精度不足以区
分120KD上添加了几个10KD。
(5). 不同的荧光技术（FRET, BRET, Quenching, PF）
如(4)，不知道如何定量。
(6).ETH有个人专门做蛋白组的，可以分离protein complexes，这个或许相关
分离不成问题，关键是定分子量。。。
除了以上建议，另外有朋友建议用Beckman 分析定量超速离心机 Beckma... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 23 Is the receptor structure or its homolog's available? If so, do conservation
mapping to its surface. I would predict the binding pocket is 1) conserved;
2) positively charged especially Arginine; 3) some aromatics for pi-pi
interaction with bases of nucleic acid. This is the cheapest and first step
for whatever following up experiments.
If no structure available whatsoever, do a structure with/without ligand.
For biochemical experiments, UV-crosslinking and then MS-ID isn't a bad
option. |
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e********r
发帖数: 147 | 24 谢谢！信息量很大，看来还不是件太容易的事。类似蛋白的结构是有的，我们照您说的
预测一下看看有无可能。另，正在搞清what is uv-crosslinking with MS-ID
conservation
conserved;
step |
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K******S
发帖数: 10109 | 25 CHIP第一步不的crosslink蛋白和DNA吗，当然和提总蛋白后做co-ip不一样
：你如何control？
： |
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n******7
发帖数: 12463 | 26 可以试试先做crosslinking
在做size-exclusion column SDS-PAGE啥的
另外，还可以试试电镜 |
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发帖数: 1 | 27 大家好，
这个星期第一次做CHIP.完整的protocol就不贴了，但：
1. reverse crosslink 在65℃上热了16个小时。
2. 然后加proteinaseK在37℃热了2个小时。
3. 纯化DNA用的是phenol/chlorofoam.做这一步的时候有点怪。加了phenol/
chlorofoam然后spin down，可以看到aqueous layer和organic layer,但中间的那层
lipid layer基本上就没有。
最奇怪的是phenol/chlorofoam的最后几步。我把aqueous layer提出后加ethanol+NaCl
+glycogen, 然后放零下80℃三个小时后spin down, 居然看到一个有我半个小拇指指甲
大的白色的precipitate.当时我就觉得有点不对劲。但我用70%ethanol洗了一遍之后，
这个precipitate的体积马上减少了90%多，颜色也变蓝了（我们用的glycogen是蓝色的
glycoblue).之后我再洗了一遍。
最后我用nanodrop测，发现所有sample的260/280都只有1.... 阅读全帖 |
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l******3
发帖数: 24 | 28 250ul 到 500ul PBS重悬细胞后，用1% formaldehyde固定，发现立即结团。各位大神
觉得是什么问题？
也有试过直接在dish上固定细胞，然后刮下来，似乎大部分都是结团的细胞。好苦恼啊
！ |
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l******3
发帖数: 24 | 30
10ml
Thanks so much. Your information is really helpful. I will give a try.The
reason I initially tried fixing cells in eppendorf tubes with such a high
density was because I followed the protocol by Covarisinc (the
ultrasonicator I am using). |
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h****n
发帖数: 92 | 32 我原来也遇到过类似问题，基本上就是细胞太多，而且贴壁细胞消化以后可能膜不完整
，更容易成团。有时候固定时间太长也会成团。 |
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l******3
发帖数: 24 | 34 很有可能，我一加入formaldehyde就开始结团。或许降低细胞密度有帮助。目前我试了
两次dish上固定，看起来还行。 |
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f*******e
发帖数: 354 | 35 大部分人不都是dish上直接固定嘛，就是损失会大一点，结块就是细胞太密然后酶消化
造成的呗 |
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d********m
发帖数: 3662 | 36 chromosome long range interaction这个绝对不是烂坑，和small rna这个领域完全是
不一样的。就说我提到的几个人，个个都是特别严谨，口碑很好的科学家。
job dekker, erez lieberman这几个就不用说了。但是hic现在的问题还是crosslink的
方法，质疑的人特别多。cornell的john liz在做一个互补的方法验证hic，这个坑可以
暂时别跳，静观其变。 |
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发帖数: 1 | 37 hi-c好贵，计算量大，中小实验室做不起啊
targeted hic可以是个选择，例如stunnenberg最近cell stem cell上的方法
[在 dimorphism (雷小阿伦) 的大作中提到：]
:chromosome long range interaction这个绝对不是烂坑，和small rna这个领域完全
是不一样的。就说我提到的几个人，个个都是特别严谨，口碑很好的科学家。
:job dekker, erez lieberman这几个就不用说了。但是hic现在的问题还是crosslink
的方法，质疑的人特别多。cornell的john liz在做一个互补的方法验证hic，这个坑可
以暂时别跳，静观其变。 |
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发帖数: 1 | 38 加上生物验证就有意义了，例如用cas9删除一个interaction区域，能影响基因的表达
和生物学功能
[在 dimorphism (雷小阿伦) 的大作中提到：]
:chromosome long range interaction这个绝对不是烂坑，和small rna这个领域完全
是不一样的。就说我提到的几个人，个个都是特别严谨，口碑很好的科学家。
:job dekker, erez lieberman这几个就不用说了。但是hic现在的问题还是crosslink
的方法，质疑的人特别多。cornell的john liz在做一个互补的方法验证hic，这个坑可
以暂时别跳，静观其变。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 39 我们实验室重点研究的就一个基因（这也是在这边为啥发愁的原因，一直不知道该研究
啥）。目前手头积累了各种和这个基因相关的database来源数据，提示可以往3D
genome这个方向试试。我第一步打算从这个基因的ChIP-seq上拓展到ChIA-seq，看它影
响的3D genome结构。至于Hi-C，至少目前对我来说还不是必须的。
不过你说的crosslink问题，如果我现在入手做ChIA-Seq，肯定要用这个办法的，好像
避免不了。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 40 我理解的Hi-c就是全基因组所有interaction位点都要找全，貌似我目前还用不到。 我
们做肿瘤的多数是从一个蛋白入手去研究机制，所以我准备用我感兴趣的蛋白做ChIA-
seq，虽然目前各种分析数据提示可能有作用，但是是不是真能做出来，心里很没底，
有点撞大运的感觉。
crosslink |
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Z******5
发帖数: 435 | 41 恩，所以往这个坑跳的另外一个原因就是有cas9的手段去研究感兴趣的位点的function。
crosslink |
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发帖数: 1 | 42 ChIA-seq不容易，需要抗体。试试3c-seq, 或者targeted chromatin capture既然你有
viewpoint…
[在 Zifeng85 (Zifeng9527) 的大作中提到：]
:我理解的Hi-c就是全基因组所有interaction位点都要找全，貌似我目前还用不到。
我们做肿瘤的多数是从一个蛋白入手去研究机制，所以我准备用我感兴趣的蛋白做ChIA-
:seq，虽然目前各种分析数据提示可能有作用，但是是不是真能做出来，心里很没底，
:有点撞大运的感觉。
:crosslink |
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d********m
发帖数: 3662 | 43 frog eggs?
只要能crosslink + 测序就行吧。erez实验室做的物种的种间和时间跨度大到吓死个人。 |
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z*t
发帖数: 863 | 44 你这个是什么细胞？
现在Hi-C 有好多的database可以看
Yue Feng lab @ PSU
Juiciebox里面也有好多
：我们实验室重点研究的就一个基因（这也是在这边为啥发愁的原因，一直不知道该研
究啥）。目前手头积累了各种和这个基因相关的database来源数据，提示可以往3D
：genome这个方向试试。我第一步打算从这个基因的ChIP-seq上拓展到ChIA-seq，看它
影响的3D genome结构。至于Hi-C，至少目前对我来说还不是必须的。
：不过你说的crosslink问题，如果我现在入手做ChIA-Seq，肯定要用这个办法的，好像
：避免不了。 |
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r***z
发帖数: 19 | 45 求文章链接，查了一下stunnenberg最近cell stem cell发的是
DNA Methylation Dynamics of Human Hematopoietic Stem Cell Differentiation
是这篇吗？
crosslink |
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R****n
发帖数: 708 | 46 最近有个项目要检测H3 modification和DNA modification的关系，做一些前期的试验
。准备pulldown histone, reversecrolink, 收集DNA做Dot blot.
直到SONICATION这一步都行,Chromatin reverse crosslink后 DNA在agar gel H3 在
page gel上都有信号。 但是pulldown后没有信号。主要基于 Farnham protocol。
他的ChIP buffer就是RIPA,beads也没有block,这个没问题么？有些别的protocol用
salmon DNA block beads,salmon DNA的methylation会影响 DNA methylation dot
blot结果吧？ |
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m*****e
发帖数: 1506 | 49 Karen Wooley组最近有工作，去查关于cationic shell-crosslinked nanoparticle的
文章吧。要从PAA-PS转换过去。 |
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l**y
发帖数: 595 | 50 这个crosslinked core-shell有什么特别吗 |
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