a*****c
发帖数: 3525 | 1 大学无机实验课是一年轻在读硕士/博士/毕业硕士（忘了是哪个）的女老师带的。陈老
师说话略带鼻音，说话有点磁性，温和带着关爱着我们这些刚入学的小同学。她每次带
我们做实验都很认真负责，而且，实验记录报告批改很详细。
有次，因为要用到分光光度计，从她手里接过那个小小的cuvette时，她松手指之前，
我没接上，cuvette直接掉到地上，啪！摔碎。当时，我心里咯噔，坏了，这回要唉骂
了。陈老师安慰我说没事，下回注意点，她又去拿了一个cuvette来给我们做实验用。
后来，不知道是第一学期结束之后第二学期之初，还是第一学期邻近期末，听说她要去
法国，追随她的男朋友/老公去，离开了大工。走之前，我们班不少学生去她住的宿舍
——机械馆——送她，我也去了，但我当时什么印象都没有，就是去看看。
时间隔了N年，往昔的记忆依然闪烁。曾经的岁月流逝沉淀，只剩下永久的记忆骨干。 |
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a*****c
发帖数: 3525 | 2 这几天因为在用cuvette，石英的，一个要花$199.5，自然就想到当初不小心，没接好
cuvette而掉地上打坏了的事情。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 我看了一下lavapep，样品体积最少要100ul，而且我估计那样的话还需要特殊的
cuvette吧。我倒是可以多配一点样品，就是不知道仪器和cuvette上哪弄去。要是还用
Nanodrop的话，岂不是绕了一圈又回来了。。。
还有就是它的定量怎么个定法，是像bradford一样做标准曲线么？ |
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a****n
发帖数: 3082 | 4 It is related to the path length of cuvette. According to my experience
about 0.1mg/ml for 1mm cuvette will not saturate the detector. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 我倒是想过，不过我们实验室自从买了nanodrop之后，旧的UV-Vis spec都不知道扔哪
儿去了。而且我用来测的样品体积不够大，可能要特殊的cuvette才行。要是稀释的话
，又引入更多误差了。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 谢谢楼上各位，尤其是mmzz同学。
我想了想，这个reproducibility的问题还是nanodrop的工作原理决定的，nanodrop工
作时的光径只有1mm或者0.2mm。然后把测到的absorbance再转换成10mm光径下的
absorbance。所以OD 0.3的样品，实际上nanodrop测到的absorbance只有0.03甚至更低
，这么低的reading，就很容易受到干扰，所以不太能够精准的测量低浓度的样品。如
果要提高精确度，就必须增强被测量的信号强度，拉大signal/noise ratio，所以用
BCA或者荧光试剂还是有用的。或者用特殊的cuvette和UV-spec，既增加光径，但是又
不需要过大的样品体积，就是不知道有没有这种设备。
不知道我想得有没有道理。 |
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m**z
发帖数: 787 | 8 Glad to help!:)
the smallest cuvette on a UV-spec I have used needs 100 ul sample, with a
pathlength of 1cm.
我觉得你对nanodrop的理解是蛮正确的，它节省了样品，但是pay off是稳定性和精确
性。我一般的molecular biology的东西，nanodrop还是很方便的，但是蛋白我总是用
大的UV-spec，尤其是新purify的protein stock,需要精确定量的时候 |
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s********n
发帖数: 2939 | 9 QuantiPro BCA Assay Kit (Sigma) 的线性范围是0.5-30 ug/ml，样品体积是50 ul，
用96-well plate做，效果很好。
如果你还是倾向于UV，你可以试试岛津的微量cuvette - 5 ul体积，1 cm的光径。 |
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m**z
发帖数: 787 | 10 CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大 |
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o****e
发帖数: 1011 | 11 楼主做CD怕信号小的话，可以用path length大些的cuvette。
（不过需要的volume也要相对多一点儿） |
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d***y
发帖数: 299 | 12
RT, 1.3X107cell+10ug DNA in 300ul Serum free medium, RT 10 min.
电击完了以后是在室温放10min吗？
Put cells in medium (10ml) immediately after electroporation.
BTW: use 4mm gap cuvettes for electroporation |
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发帖数: 1 | 13 最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个孔。
以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
replicate呢？
而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
之所以问这个问题是因为后来面对转染neuron的实验。neuron比较难转染所以用的是
nucleofection，一次性用cuvette转染100万个细胞，然后分到12-well的3个孔中。
同样的实验过两天我也会一模一样的再重复一次。
对于neuron的转染，分到3个孔中的... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 14 技术重复是看你操作有没有失误；生物重复是看你实验本身（这里是细胞）有没有有统
计意义的差异。
[在 flareon () 的大作中提到：]
:最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
:一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
:我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
:个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个
孔。
:以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
:我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
:replicate呢？
:而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
:之所以问这个问题是因为后来面对转染neuron的实验。neuron比较难转染所以用的是
:nucleofection... 阅读全帖 |
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G***G
发帖数: 16778 | 15 your experiments after two days are biological replicate.
five replicates at the same times are technical replicate.
最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个孔。
以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
replicate呢？
而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
之所以问这个问题是因为后来面对转染neur... 阅读全帖 |
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E****e
发帖数: 315 | 16 440mg/20mL = 22 mg/mL
需要稀释很多倍才好测UV,除非你用的是特殊的CUVETTE |
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h******o
发帖数: 207 | 17 测紫外光谱，水晶可透紫外，玻璃有强吸收峰。
这是紫外可见光谱必须用水晶cuvette的原因。 |
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