h***l
发帖数: 168 | 1 right, chromocenters - clusters of centromeres, pericentric heterochromatin,
and telomeres. |
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S*****s
发帖数: 287 | 2 我用过 Invitrogen 的 Annexin V-Alexa488/7-AAD kit，蛮好用。为了回你这个帖我
去 Invitrogen 网站的 Fluorescence SpectraViewer 查了一下，结果贴在后面了。
RFP 的 excitation 和 7-AAD 一样，但是 emission 不一样。RFP 的 emission 是红
色而7-AAD 的 emission 是红外的，flow 机器应该能把两个分开。如果 RFP 的表达量
和细胞凋亡没关系的话更应该如此。真的想省心可以考虑 Annexin V-Alexa488 和
DAPI 一起用，这样三个颜色分得很开肯定不会有问题。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 3 我喜欢488,568,647，前面还能加DAPI |
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V********n
发帖数: 305 | 4 488, 555, 647 plus DAPI
Invitrogen has them |
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s******y
发帖数: 28562 | 5
我也经常有这个麻烦，后来我就采用DAPI 染核来数，就准确多了。
另外，细胞分布的确不是很均匀，但是只要你重复足够多次，最后的数据还是
可以用的
这个，关于细胞脱离不重复的事情，还是老话，要重复足够多次，
至于膜上面的细胞？这个不太可能穿过膜掉下来的，太难了
如果你不放心的话，做一个control, 把细胞放在没有gradient 的情况下adhere 1个小
时，然后用cell dissociation kit |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 是啊，因为DAPI 是染细胞核DNA的，背景很低，而且细胞核圆圆的，
一眼就看出来了。
可以先照照片也可以直接数。 |
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s**********e
发帖数: 2888 | 7 谢谢了，用了你的方法。合作实验室有一台比较高级的显微镜，可以扫描整个dapi
stained membrane，然后用软件计算膜上面的细胞数，效果非常的好。
觉得现在的仪器真的是先进啊，呵呵，显微镜扫描出上百招照片，每张照片大概10%
overlap，然后软件把这些照片拼成一张大照片，拿到一张完整的membrane的荧光照片。 |
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i****n
发帖数: 56 | 8 Genome. 2011 Jan;54(1):26-32.
Karyotype of Zea luxurians and Z. mays subsp. mays using FISH/DAPI, and
analysis of meiotic behavior of
hybrids.
González GE, Poggio L.
Pubmed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?
term=Karyotype+of+Zea+luxurians+and+Z.+mays+subsp.+mays+using+FISH%2FDAPI,+
and+analysis+of+m
eiotic+behavior+of+hybrids
Please send paper to h****[email protected]
Thank you very much!!! |
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Z****9
发帖数: 738 | 9 如果在DAPI，GFP或者red channel中的两或者3道能看到信号，基本上就是auto
如果只在一道里看到，很有可能是信号
最科学的方法是用Lamda模式，看Em的spectrum和对应的FP的em对比 |
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b****o
发帖数: 193 | 10 Gram-stain
DAPI
FISH比较麻烦，用细菌通用荧光探针Eu-388. |
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c******g
发帖数: 49 | 11 DAPI filter一般是400LP，只有emission波长超过400才能通过，看看你的显微镜能不
能激发Alexa405.
647 人眼可见。 |
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c******g
发帖数: 49 | 12 DAPI filter一般是400LP，只有emission波长超过400才能通过，看看你的显微镜能不
能激发Alexa405.
647 人眼可见。 |
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V********n
发帖数: 305 | 13 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
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V********n
发帖数: 305 | 14 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 15 4个颜色。
GFP, DAPI, Alex 568, Alex 647 as yellow.
many
with |
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I***a
发帖数: 13467 | 16 DAPI 染DNA的，358 nm，blue，很便宜， |
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f*******a
发帖数: 671 | 17 1. 0.05% trypson
2. 0.09% NaN3 is toxic. THere is no need to add this while doing live
staining.
3.why do you use 500g? 200g is enough.
4. Wash once instead of 3 times. Live staining usually does not have high
background. Given that the incubation time is 15min on ice. The buffer must
contain 5% NDS
5. Use low pressure while sorting. Use a DAPI or PI to exclude dead cells. |
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f*******a
发帖数: 671 | 18 有一片综述，上面有一个list, 我记得最亮的是PE(488).APC(633)也是最亮的之一。
如果只用两种颜色，我就用这两个，因为不需要做compensation.死细胞可以用DAPI 但
是PE, APC不适合在显微镜下面看，因为photobleach很快。但是非常适合于流式，因为
信噪比高。
如果是3种颜色我会再选A594或者A555,因为激发光不同，不需要compensation.
因为compensation永远都会导致信号的损失。
另外还看看你们实验室的仪器是不是有这么多laser. |
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e**o
发帖数: 345 | 19 如图。
以前没看到过这么多洞洞啊。不过这次染色之前，周末懒了一次，没有去换液。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 20 可能是nucleoli，或者Cajal bodies？ |
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s**********e
发帖数: 2888 | 23 不是直接回答你的问题，我一般是用DAPI染色，然后这样数细胞很清楚。这个assay不
稳定，需要很多次的重复，才可以拿到比较consistent的细胞数目变化的结果。所以，
我估计如果你想进一步作antibody，问题可能更大。
我似乎发现癌细胞还好做一点，primary endothelial cells似乎更难做。
请问能做antibody immunostaining吗？如果可以的话，有详细的protocol可以share吗
？另外如果想收细胞提RNA什么的应该怎么操作呢？ |
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w******2
发帖数: 64 | 24 直接在突变位点设计引物overlapping. 用保真酶pcr, DapI 消化PCR产物， 转化， 挑
克隆测序。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 可以染，但是浓度要比平常用的高１０～１００倍才能染上足够的亮度。
所以一般人不到迫不得已不会这么做（浪费试剂）。 |
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b***2
发帖数: 348 | 26 我从来都是hoescht33342直接染活细胞。这种东西又不贵，几十块钱买的用了一两年都
没有用完，没有什么好担心价钱的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 Hoechst 33324 是什么颜色的？也是用UV 激发然后呈蓝色么？ |
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G********e
发帖数: 528 | 28 请教一下这位批量高手
怎么选择region of interest？
我想对细胞核内的546频道的信号进行定量，
某位高手叫我用手拿着鼠标描着dapi画的
非常考验美术细胞
有什么绝招吗？ |
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m******h
发帖数: 32 | 29 1, threshod dapi chanel
2, 用魔术棒选择核区，添加到ROI manage。
3，回到546chanel，重选这个ROI。
4， Ctrl + M。 |
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G********e
发帖数: 528 | 30 多谢，我的dapi有点弱，经常核里有黑洞，下次曝光久一点可能就不会
不过即使这样做，批量也挺辛苦的
可能image分析都是很需要人力的
有没有人知道怎么对细胞核不同的区域进行定量分析
比如说一个特定的蛋白喜欢靠在核周边
可不可以把细胞核一步一步shrink，然后对不同的shell进行定量 |
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w********r
发帖数: 1431 | 31 我们通常用BD的trans-well。
如果看migration就直接把细胞分进去，
要是看invasion就先用matrigel coat一下，然后再把细胞分进去。
然后根据细胞migration/invasion的能力，过一段时间后，把里面那个well上层的细胞
擦掉，fix一下，用Dapi染染底部穿过去的细胞数目。时间要提前摸一下，太久了细胞
可能就掉下去了，太短了穿不过去。。。
版大赏个包子吧：） |
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v***a
发帖数: 1242 | 32 不是confocal，就是普通的荧光显微镜，看四种荧光（其中包括DAPI），大家有推荐的
荧光染料吗？谢谢！ |
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r****r
发帖数: 36 | 33 if you can stain it with DAPI, they must be DNA. under what circumstance you
can find DNA outside the nucleus? :) |
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h********n
发帖数: 4079 | 34 if you find DAPI staining positive outside a cell, it could be mycoplasm.
Buy a dectection kit and test it. |
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h********n
发帖数: 4079 | 35 老鼠组织冰冻切片, 有些细胞有RFP, 还要染DAPI, 用什么做fix比较好啊?
谢谢. |
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b****s
发帖数: 148 | 36 是nucleoli，DAPI或Hoechst都染的
每个nucleus里边可以有很多个 |
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l***y
发帖数: 4671 | 37 人家问得是最大厚度啊。估计是要做 confocal 吧。
我也有这个问题。做小鼠的骨髓切片，我们这里死活也做不到 50um 以上，更别说我希
望的 200um 了。而且骨髓还碎得一塌糊涂，同时骨髓和骨的内壁分离。也不知道是脱
钙脱水时就已经碎了，还是切的时候造成的，还是两者都有。5um 的片子就好得多，但
也有碎的。哪位知道如何可以切得厚？
另外就是厚片子染 DAPI 进不去，外面噪音大，里面没信号。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 38 Sure.
LZ pls refer one 2012article from Harvad
Optical Coherence Microscopy (OCM) for in vivo imaging of neuronal cell
bodies and cortical myelination up to depths of ~1.3 mm in the rat neocortex
by
Srinivasan VJ et al. (2012)
Optical coherence microscopy for deep tissue imaging of the cerebral cortex
with intrinsic contrast.
Opt Express. 20: 2220-39.
its PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22330462
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人家问得是最大厚度啊。估计是要做 confocal 吧。
我也有这个问题。做小鼠的骨髓切片，我们这里死活也做... 阅读全帖 |
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F*K
发帖数: 608 | 39 转了一个质粒到293T，免疫荧光定位在核内的网状结构 （附图，左。 右边是DAPI）
请问这是什么结构呢，谢谢 |
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h****r
发帖数: 152 | 40 我没看过很多细胞。但是有个疑问：如果dapi染的是核的话，为什么会靠得这么近呢？ |
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a*q
发帖数: 2109 | 41 405 nm 激发 450 nm 荧光 （例如DAPI）
488 nm 激发 510 nm 荧光 （例如GFP，Alexa 488）
561 nm 激发 570 nm 荧光 （例如mCherry，Alexa 555）
647 nm 激发 670 nm 荧光 （例如Cy5，Alexa 647）
以上为四色同时成像的常见选择，基本没有太多Crosstalk。 |
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p**t
发帖数: 160 | 42 We are talking about science here. Not necessary to comment on others.
LZ did not give much information of his experiment, so what you listed
in below is also pure speculation.
Here I attach a pic what I stained with LYVE-1 in LN,
which is also inflammatory.
The red signal is LYVE-1, blue is B cell region.
Fat should not be problem in isolating LN.
I agree with you that there might be problem of specific staining.
I assume that in the LN of his model, here might be expansion of
both macrophages ... 阅读全帖 |
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k***g
发帖数: 4904 | 44 上次来这请教，有牛人推荐DAPI 和hoechst，我简单查了一下好像主要卖的都是UV激发
，发射蓝光？请问常用的有蓝、绿或红光激发的核酸染料吗，同一系列能有多种波长可
选的更好。谢谢指教！
我把上个帖子copy下面了
生物盲求推荐，以前我们实验用的一直都是celltracker系列dye，不过这种dye虽然不
是直接coat在细胞膜外，好像也还是有影响细胞膜性质的争议吧？想买几种直接染遗传
物质的dye，不需要保持细胞活性，我们用的就是死细菌。希望这类dye价格便宜，荧光
效率高，标记操作简单而且可以穿透较密的细菌cellwall，但是不会影响cellwall外面
的化学性质，（因为我们的实验基于细胞外表面化学性质） 标记后寿命越长越好（价
格相同的情况下），能有几种波长（蓝绿红）激发的可选。因为没接触过，现在无从下
手。谁能给点可选的建议，我再去查查？多谢了！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 45 。。。。选择区域的时候按control或者command，然后就可以拉。
如果你是有多种颜色或者要normalize to DAPI，你可以把选中的区域设成ROI |
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c********r
发帖数: 23 | 46 现在养的细胞在玻璃的coverslip上长的形态不好，可是在culture dish里没问题。在
玻璃coverslip上附着了poly-lysine/collagen/gelatin也没有太大帮助。想试一下
plastic或其他材质的coverslip/slide, 但查了一下好像一般autofluorescence比较强
。由于后续要做荧光染色，需要用到FTIC/rhodamine/DAPI，普通的plastic可能不行。
lab-tek有一种permanox plastic chamberslide号称minimal autofluorescence，不知
有人用过没？如果有人知道其他材质的plastic coverslip/slide适合用于荧光染色也
麻烦推荐一下。非常感谢！ |
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c****1
发帖数: 1095 | 48 用慢病毒感染海马。目标CA1。
在有的切片上可以在CA1看到注射的痕迹，说明target到正确的位置。
但是，发现感染的区域大部分在cortex和海马交界的地方（红色是细胞核的DAPI染色）
。还有别的老鼠，感染的区域在DG和CA1之间的区域。我觉得，这是因为注射的速度不
够慢，或者注射的体积太大（1uL），导致病毒漏出去了，感染了覆盖在海马表面的包
膜，也感染了少数cortex的细胞。
老板固执的认为，那些感染的区域是海马的axon bundle。我说，都没有看到几个海马
的neuron被感染，他们的axon怎么会那么亮。他说，需要染色才能看到。他还说，要我
搞清楚那些被感染的区域究竟是什么机构，要证据。我无语。
请教下有经验的朋友。你们碰到这种情况么？这些被感染的，是不是结缔组织？
多谢！ |
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E*********s
发帖数: 93 | 50 DAPI staining. Human cell nuclei and mouse cell nuclei look different. Mouse
nuclei has punctate staining inside the nuclei. |
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