发帖数: 1 | 1 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用
邬旭龙1Δ, 肖璐2Δ, 宋勇5, 林华4, 陈世界4, 杨苗4, 安微4, 姚学萍1,3, 杨泽晓1,
3, 王印1,3
摘要：【目的】 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能导致猪群高死亡
率，从而造成严重的经济损失。因此，建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的
诊断方法以及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而
高灵敏度的ASFV微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)检测方法。【方法】 针
对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和TaqMan探针，通过反应条件优化，建立了ASFV
实时荧光定量PCR (qPCR)和ddPCR检测方法；并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异
性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血
清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的
符合率。【结果】 建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法线性... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 2 Bio-Rad微滴式数字PCR技术（ddPCR）是第三代PCR技术，无需标准参照物质即可给出
样本的拷贝数浓度而非Ct值，其检测结果为判读提供量化的依据。根据LOB(limit of
blank)和未知样本的定量结果作出判读，可避免人为错误，缩小灰区，提高检出率。
ddPCR独有的微滴处理技术，使其对PCR扩增效率的变化不再敏感，不惧含有PCR抑制物
样本的挑战。随着疫情的变化以及流行病学调研的推进，更多类型的检测乃至环境监测
也可能需要进行，ddPCR的这一优势会发挥作用。此外，如果新型冠状病毒发生变异，
病毒基因序列上引物、探针靶向位置出现SNV，ddPCR亦能克服引物、探针结合能力下降
带来的扩增效率变化，确保稳定检出。不仅如此，还能根据样本微滴荧光信号的变化，
发现引物探针靶标区域可能出现变异的病例，为NGS测序分析病毒变异提供样本，助力
流行病学研究。 |
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发帖数: 1 | 3 不是有的时候是真的灵敏度不过，不能和背景ct值分开
这个时候就要上ddPCR,灵敏度直上单分子核酸，有一点儿都能给你查出来，
ddPCR本来就是专门干检测超微量基因突变用的，
现在没有抗体，只能用ddPCR |
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发帖数: 1 | 4 ddPCR 没有问题的，放心吧，只有假阳性，没有假阴性
Digital PCR as a tool to measure HIV persistence
Although antiretroviral therapy is able to suppress HIV replication in
infected patients, the virus persists and rebounds when treatment is stopped
. In order to find a cure that can eradicate the latent reservoir, one must
be able to quantify the persisting virus. Traditionally, HIV persistence
studies have used real-time PCR (qPCR) to measure the viral reservoir
represented by HIV DNA and RNA. Most recently, digital P... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 5 没有上ddPCR检测出那些低浓度病毒
必须上ddPCR了 |
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s**u
发帖数: 9035 | 6 Req Number: L11-177
Location(s): Boston MA
Career Field: Sales/Field Applications Scientist
Education: MS/PhD
Duties and Responsibilities:
Digital PCR Specialist Position
The successful candidate will utilize their knowledge and understanding of
digital PCR technologies to develop and support sales initiatives in the
United States. As part of the QuantaLife team in the Gene Expression
Division, this position will serve as the key liaison between the customer
and QuantaLife. The Specialis... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 351 | 7 Raindance和Bio-Rad的ddPCR的原理是不一样的。
Raindance出来的结果不直观，而且不是绝对定量。
ddPCR定量的原理利用的是泊松分布，在低浓度范围内定量挺准，缺点是定量范围比较
窄。 |
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a******a
发帖数: 283 | 8 Here is a technology question. I know it should be possible to improve the
result and would like to hear some more suggestions.
Basically we are trying to push the limit of detection to the level of 10e4
or even 10e3, for viral RNA isolated from animal blood samples, for
pharmacokinetic study.
Our samples contain mostly carrier RNA with viral RNA of interest.
And with SBYR or TaqMan, we can stably detect 200-300 copies per well (of 96
-well setting), that translates into 10e5 copies/ml with our ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 9 都告诉你了用ddPCR，你还要顾左右而言它，什么意思？ |
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发帖数: 1 | 10 ddPCR比传统的real time PCR要好点，就是调参数和底峰杂峰方面
但是对起始RNA样品的要求并没有降低，医院那个水平，那么乱，怎么可能弄得的好的
起始检测样本
再说如果用biorad的试剂盒，麻痹tg会被搞破产的，那么多病人，怎么买得起 |
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发帖数: 1 | 11 降低了，可以稀释那些抑制PCR反应因子的浓度，
再没有拿到抗体前，可以先用ddPCR把原来假阴性的样本在复查一遍 |
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发帖数: 1 | 12 钱啊，山寨试剂盒不知道做ddPCR效果怎么样，从来没接触过山寨的，如果用bioRAD试
剂盒，那得多少钱啊。还有real time PCR仪，那得多少钱啊，小地方根本没有，武汉
也不是白菜那样多，小地方如何送样？背着液氮罐跑吗？这个是RNA样品，不是DNA |
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发帖数: 1 | 13 如果灵敏度不够，你就是四个平行样也没用，
以前假阴性的样品，再用ddPCR再测一遍，如果还是阴性，那就很可能是采集样本出了
问题，如果测出来都是阳性，那就果断放弃传统荧光PCR |
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发帖数: 1 | 15 刘鹤副总理不是刚签了2000亿美元的单子吗，撒开了买Bio-Rad,这才叫钱花到刀刃上，
而且ddPCR很可能能帮助找出那些没有症状却带毒的新冠“伤寒玛丽” |
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l****n
发帖数: 844 | 19 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: linden (说LP不对的参见第一条), 信区: Biology
标 题: 湾区biotech startup招RA
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Feb 3 14:14:07 2015, 美东)
Research Associate, Assay Development
AccuraGen Inc. is a silicon valley based early-stage biotech startup
focusing on noninvasive diagnostics to facilitate personalized cancer
treatment. We are developing systems providing the most sensitive,accurate,
and robust NGS based ctDNA mutation detection, delivering unparalleled
accuracy from a minimal amount of patien... 阅读全帖 |
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c********4
发帖数: 111 | 20 Raindance has smaller droplets (more partitions), but the reading time is
way too long and their product seems not available yet.
Life Tech also has a new one (chamber mechanism as fluidigm , rather than
droplets), don't know about the performance.
Bio-Rad's ddPCR is from previous Quantalife, a lot cases and applications
accumulation with lower price. |
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a******a
发帖数: 283 | 21 这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。 |
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a******a
发帖数: 283 | 22 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
有没有建议？
另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
什么好的protocol吗？
这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。 |
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d*****e
发帖数: 38 | 23 靠谱，用ddPCR Sib selection |
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l****n
发帖数: 844 | 24 Research Associate, Assay Development
AccuraGen Inc. is a silicon valley based early-stage biotech startup
focusing on noninvasive diagnostics to facilitate personalized cancer
treatment. We are developing systems providing the most sensitive,accurate,
and robust NGS based ctDNA mutation detection, delivering unparalleled
accuracy from a minimal amount of patient blood samples.
AccuraGen is looking for an outstanding individual to join its Assay
Development team. This person will be responsible ... 阅读全帖 |
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x*x
发帖数: 9 | 25 NGS在Medical Genetics上的应用只是临床应用的一小部分。将来更为广阔的应用是在
肿瘤的测序和液体活检用于肿瘤的早筛和晚期检测预后等等上。现在已经有了相当的应
用，我们系里面至少四分之一的医生都order过Foundation Medicine或者Guardant
Health的NGS检验，用来辅助治疗肿瘤病人，尤其是对一线或二线治疗已经不反应的晚
期病人。不过整体发展依旧受限于技术上的不完善，高成本，还有针对actionable
aberration的化疗以及靶向治疗的药物并不是很多。对于体细胞的突变来指导病人早筛
或者用药，通常需要用更高精度的手段，比如ddPCR来验证，sanger的精度远远不够。
ACMG
diagnostics |
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m******n
发帖数: 194 | 26 温州医科大学 丁春明教授团队招纳海内外人才
任何问题可以发丁博士邮箱：cmdingchina。。。qq.com （。。。请置换成@）
注明：
1. 需要完全独立的人才，丁博士可以推荐给校内本学院或者其他学院单独考虑
2. 丁博士在mitbbs的ID是musician, 有兴趣的人可以搜索本人的帖子，可以基本反
应本人的科研和处事态度
3. 温州医科大学的人才引进计划及待遇见: http://www.wmu.edu.cn/view.php?id=abd3f51b-a394-11e5-93d3-1942aefdd32c。本人到岗实际经验，学校能较及时兑现所有待遇
4. 本次招人为PI（研究员，正高或者副高）及其他研究人员（博士后或副高），人
数为5-10位。一般情况下均有事业编制（外籍除外）。
所需人才基本要求
1. 具有博士学位，特别优秀者不受限制
2. 专业为临床医学，病理学，检验医学，生命科学，生物信息/统计等，特别优秀
者不受限制
3. 目前或者未来研究领域和团队一致或具有明显协同作用
4. 具有团队合作精神。合适比“优秀”更重要，... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 27 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 28 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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l*******1
发帖数: 16217 | 29 Real time PCR 理论上可以
ddPCR最好 |
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l*******1
发帖数: 16217 | 30 我做过，这玩意比Real time PCR 准，如果你是想看某个突变位点的话，DDPCR 比
real time PCR 灵敏很多 |
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m****a
发帖数: 270 | 31 顺道问一下，有人用ddPCR用来分析CRISPR的效率的么？准不准？ |
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