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g*****y
发帖数: 6325 | 3 至今挑过2个。 都没有表达。。 打算在做一次transformation试试。 |
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n*********m
发帖数: 38 | 4 You can try low Temperature. But I think Cam is necessary for the induction. |
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s********n
发帖数: 2939 | 5 你是指你用的这个带有pLysS的菌株是别人engineer过的，不是commercial的？
如果是这样的话他们应该会有原始不带pLysS的菌株，问问看。
如果实在不行的话，可以试试将这个菌株在不含Cm的培养基转接几次，然后划线在不含
Cm的平板，挑取单clone再分别划线于带有Cm和不含Cm的平板，这样估计你能找到丢失
pLysS质粒的菌株。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 6 不是不是， 是他们在novogen买了plysS的细胞然后又加了一种特性。我也是这么想的
。希望不要花太多时间。 还有你知
道那里有卖那种可以把一个板子上的colony复制到另一个板子上的那种film吗？ 我想
用这个方法可能筛选快点。 |
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h*******0
发帖数: 48 | 9 我觉得很多时候不表达是因为菌种污染了
不是BL21或者菌里没有质粒
只要是含表达载体的BL21，肯定可以通过诱导表达的 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 有一个问题，万一你的蛋白不表达不是因为pLysS，而是因为这个另一个特别的属性呢
？如果是这样，那你就算把pLysS质粒想办法剔除了也还是一样解决不了问题啊。。。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 11 Sorry I couldn't type in Chinese with lab computers.
I am trying to express my protein in E.coli these days. I tried with my
construct in E.coli BL21(DE3) with 1mM
IPTG at 37C for several time points, but couldn't observe any induction.
Does this mean there is no need for
me to try any lower temperature, such as 30C, 25C,etc, since even 37C has
no induction and they all won't
have any induction as well?
Thanks! |
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
say, 33C).
Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
strain BL21(DE3)pLysS. |
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p**u
发帖数: 138 | 13 I know a friend who met similar problem (tried strain for codon bias, toxic
protein, none of them worked). He deleted about 10 amino acid at the N-
terminus of the protein, then the protein was expressed well in BL21 (DE3). |
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j*****y
发帖数: 94 | 14 跟风问一下，我现在也有同样的问题。DNA sequence没问题，也是BL21(DE3)细胞， 可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（25）或者更低（17）incubate 过夜？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 15 Hi, all,
I am using Rosetta-Gami DE3 pLySs to expression my fusion protein which is
predicted as 91kDa.
I first did the expression assay and found protein expression was induced
after adding IPTG by testing the whole cell lysate. (bacteria at certain
time points, add 2X sample buffer, boil, SDS-PAGE).
Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stain... 阅读全帖 |
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v***a
发帖数: 1242 | 16 请教一下 B-PER和Y-PER区别大吗？
我用BL21(DE3)，可以用Y-PER提吗？ |
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v***a
发帖数: 1242 | 17 实验室只有Y-PER protein extraction reagent了，我想用它提取BL21 (DE3)产生的蛋
白，不知道可不可以啊？
谢谢！ |
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b********c
发帖数: 161 | 18 2个性质,大小,pI，蛋白序列都非常相似的蛋白（paralogs）A 和 B，用的pET15b
vector， 在e.coli(DE3)中加IPTG诱导表达，然后粉碎细胞后，提取上清液可溶总蛋白
跑SDS-PAGE,A可以看到诱导的目的蛋白， 但B看不到诱导的条带。 直接load这2个蛋白
的诱导前和诱导后的 crude cell culture，A和B都可以看到诱导后的目的蛋白。所以
我不知道为什么B蛋白在粉碎细胞后不在可溶蛋白部分，甚至一点都没有，如果是形成
了inclusion body，难道一点都不剩在可溶部分里面？
我测过序列，都是正确连接的，而且用 crude cell culture做相关的生化实验，也发
现了这两个酶的效率是很高的。 |
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z*h
发帖数: 773 | 19 try this new technology -- Simple Cloning.
You, C., X.-Z. Zhang, and Y.-H. P. Zhang. 2012. Simple Cloning: direct
transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and
Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol.:doi:10.1128/AEM.07105-07111.
Abstract
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in E... 阅读全帖 |
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e******e
发帖数: 2 | 20 tranform recombinant plasmid in BL21(DE3)pLysS Competent Cells, observed
colonies in Petri dish culture, 10 mL cuture was good. cells stopped growing
when we put them into 1 liter LB broth. 细胞不长了，请问怎么办？ |
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r******t
发帖数: 629 | 21 我用ecoli（BL21 DE3）表达人的cyt c，有6 his tag。
结果37度表达就有inclusion body，而30度或者室温就压根不表达，这个也太奇怪了吧。
为啥啊？
我把30度养的culture丢进37度几个小时，它们又很欢快的表达了。
唉，不知道该怎么解决这个问题。
换个cell line？ |
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k****l
发帖数: 279 | 22 基因在哪个promoter下？如果是 T7，在expression strain 像 BL21（DE3）中表达可
能会有问题，但你克隆应该用 DH5alpha |
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z*h
发帖数: 773 | 23 Simple Cloning: direct transformation of PCR product (DNA multimer) to
Escherichia coli and Bacillus subtilis
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in Escherichia coli [e.g., TOP10, DH5α, JM109, BL21(DE3)] and
Bacillus subtilis for obtaining chimeric plasmids.
http://aem.asm.org/content/early/2011/12/16/AEM... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 24 你试试Agilent的ActicExpress (DE3) cell，这是用Gentamicin作为selection maker
，chaperone是来源于psychrophiles。
至于in vitro constitution，你也可以试试low temperature，low concentration
and high salt，low T可以减少aggregation的几率。检测最优当然是活性，不然就是
native gel/SEC/DLS。
codon |
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l*****n
发帖数: 1648 | 25 稀有的有几个影响不大，太多就不行了。我有个protein有9个CCC，在普通DE3不表达，
用codon plus就表达了。 |
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e********r
发帖数: 147 | 26 实验室用BL21(DE3)和PET系列的蛋白表达载体差不多有10年，一直都没啥问题。
可最近出现了噬菌体严重污染，蛋白表达菌株经常性的摇不起来，我们已经用了很多方
法，包括各种清洁措施、84消毒、实验室每天紫外长时间灭菌、污染区域高温处理、甲
醛熏、以及换Rosseta菌株等等，但还是控制不住。
请问有经验的朋友们，这可肿么办？ |
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e********r
发帖数: 147 | 27 实验室用BL21(DE3)和PET系列的蛋白表达载体差不多有10年，一直都没啥问题。
可最近出现了噬菌体严重污染，蛋白表达菌株经常性的摇不起来，我们已经用了很多方
法，包括各种清洁措施、84消毒、实验室每天紫外长时间灭菌、污染区域高温处理、甲
醛熏、以及换Rosseta菌株等等，但还是控制不住。
请问有经验的朋友们，这可肿么办？ |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 大家常用的表达蛋白的 E. coli Rosetta(DE3) 系列，氯霉素就是维持P15 ori的质粒
的，这个质粒上装了一些稀有的tRNA。没钱搞基因合成的，可以把这个装到自己感兴趣
的宿主菌里面，可能有助于基因表达。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 29 在pACYC质粒上吧。
Rosetta(DE3) This is a BL21 derivative designed to enhance the expression of
eukaryotic proteins that contain codons rarely used in E. coli. These
strains supply tRNA genes for AGG/AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu), CCC (Pro)
and GGA (Gly) on a ColE1 compatible chloramphenicol-resistant plasmid. Thus
the Rosetta strains provide for "universal" translation which is otherwise
limited by the codon usage of E. coli.
Available from Novagen |
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