D*a
发帖数: 6830 | 1 自己配的，
网上搜了搜，这是跟我们完全一样的protocol
Final concentration of tail digestion buffer (TDB):
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl (pH 9.0)
0.1 % Triton X-100
0.4 mg/ml Proteinase K
Add 100 ul of TDB per tail piece (2-5 mm) in a microcentrifuge tube. Be
careful not to cut too much tail.
Incubate the tube at either 60 C for 3 hours, with gentle mixing every 30
minutes, or 55 C overnight.
Incubate the tube at 94 C (or boil) for 10 minutes to denature the
Proteinase K.
Spin in microcentrifuge at top speed for 15 minutes. |
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w******e
发帖数: 1187 | 2 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
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o********r
发帖数: 775 | 3 Review
Many different tumor types have polyclonal tumor origin: Evidence and
implications
Barbara L. ParsonsCorresponding Author Contact Information, a, E-mail The
Corresponding Author
aDivision of Genetic and Reproductive Toxicology, National Center for
Toxicological Research, HFT-120, 3900 NCTR Road, USFDA, Jefferson, AR 72079,
United States
Received 7 February 2008;
revised 14 May 2008;
accepted 15 May 2008.
Available online 31 May 2008.
Abstract
Few ideas have gained such strong acceptance i... 阅读全帖 |
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s********l
发帖数: 1195 | 4 short fragments of peptides tend to aggregate over time or heated up.
larger protein molecules also aggregate once denatured.
aggregated clusters tend to precipitate out and usually it's not reversible,
which means time for a new batch of sample prep. |
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c*****e
发帖数: 619 | 6 知道很多做FISH是用的，但是查文献，发现做GISH（genomic in stu hybridization)
有的用，有的不用。
到底用salmon sperm DNA的目的是什么？ 做GISH如果加了blocking DNA还需要加这个
salmon sperm DNA吗？ 多谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 I agree. It appears that her 60kD protein may have been denatured into
aggragagte and that's why it ran out in the void volume |
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m**z
发帖数: 787 | 8 1. in-gel tryptic digestion followed by MS or MS-MS
2. ESI-MS or functional assay
3. CD denaturation
4. cys oxidation and others? not quite sure, guess depends on the mass
difference
5. not sure... MS-MS?
6. increase salt, change buffer condition, lower temperature, add a ligand
to stabilize, etc. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 你把这个蛋白跟另外一个共表达，一个有tag，一个没有
如果出来complex，（native gel, SEC），不是也是一个他们相互作用的证据么？
另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少？
还有如果实在不行，可以denature条件下纯化这个蛋白
13 kDa这么小，重折叠不是什么大问题
另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多，不如试试你的GST-tag的那个
虽然一开始表达的少
但大不了多摇点菌
GST应该可以帮助稳定这个蛋白
前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
纯化好了蛋白再把GST切掉（我假设你的fusion protein是有特异性蛋白水解酶酶切位
点给你切GST的） |
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m**z
发帖数: 787 | 10 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已，一般不会去这么干吧 |
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k****u
发帖数: 3454 | 11 用salt和water，不要用organic solvent，可以minimize denaturation
当然，我没干过，只是纸上谈兵-_- |
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
——250 mM还好啦
试试看500 mM
给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
一个选择 |
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c********e
发帖数: 598 | 13
I did some experiment using plasma long times ago. In my hand, our
machine can denature the proteins. The builders and I would never dare
to use it to sterilize our skin. |
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j*****a
发帖数: 658 | 14 what lysis buffer did you use? I am wondering if RIPA buffer/denature buffer
is okay for IP......
Do you know anything about this? THanks!
western |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 嗯，我没想过这个denature的问题。
对我来说，non-ionic对lipid作用比较强，对蛋白－蛋白作用弱，所以能去除比较弱
的蛋白相互作用。ionic的分离蛋白作用强点，0.1%SDS还是很稀，不至于蛋白全变性，
能够去掉中等的相互作用，并且溶解一下不好溶的蛋白。
ionic
recognizes
these |
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b*****l
发帖数: 9499 | 16 没看懂。。。是说同一套 kit，镜下没问题，FACS 有问题？两者的 denature 方法一
样么？还是用的不同的 antibody/方法？另外，镜下和 FACS 可以交叉验证的：FACS
染色后可以 mount 到片子上镜下看，而为镜下染色用的 kit 也可以尝试做 FACS 来对
照。还有，这个 brdu-kit 在你手下曾经 work 过么？如果第一次用，是不是先找个类
似的 cell line 做个 in vitro 的 positive control 先？ |
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c*********r
发帖数: 1312 | 17 好像Qiagen的RNA提取的试剂盒就可以，隐约记得说明书上有说把RNA binding之后的溶
液可以留着做蛋白提取。
Appendix F: Acetone Precipitation of Protein from Buffer RLT Lysates 72
http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=1&sqi=2&ved=0CBMQF
不过“The precipitated, denatured protein is suitable for applications such
as SDS-PAGE, western blotting, and 2D gel electrophoresis.”不知道是否时候MS
。但PAGE之后还是可以MS的吧。 |
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n******5
发帖数: 21 | 18 我觉得M-beads, 主要是方便，和 minimized carry-over therefore increase
recovery. if you want to minize non-specific interactions, try follow some
naked beads to absorb them.
但是缺点就是 binding capacity 很低。
Wash buffer:建议加一些non-ionic detergent, like Triton100
Elution buffer: SDS+boil will get everything off, but all in denatured form,
it is perfectly fine if you directly go on to SDSPAGE.
if you want to maintain functional activity, I would suggest using low pH
elution (Try pH2.0 glycine, use Tris-pH8 to neutra... 阅读全帖 |
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b*******3
发帖数: 99 | 19 有什么说头?
好象多数人都是要高温变性啊.
谢谢你的提示哦.
能具体说说吗?给个连接吧.
Denature |
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b****r
发帖数: 17995 | 20 37度蛋白真的会变性吗？
不变性的话不是有抗原被隐藏的危险
Denature |
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b*******3
发帖数: 99 | 21 不知道做不出来的原因到底是什么.
1不应该95度DENATURE
2应该去糖基化
3其他 |
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c**********6
发帖数: 1173 | 22 你这样的条件足够强了，没有道理分不开
可能是你的urea gel不够好，我用过的invitrogen和biorad的precast gel的
denaturation效果都不如自己配置的8M的acrylamide gel好
然后，我觉得0.05M的NaOH 95C 30min 可能太强了，多条带有可能和DNA的degradation
有关吧 |
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x*****o
发帖数: 441 | 23 不是太懂NMR,不知道你的核磁结果的解释是什么.
你的hairpin stem是不是GC rich,会不会没有闭合.你的Tm是多少?
还有non-denaturing gel 怎么确定不是dimer? |
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z***q
发帖数: 907 | 24 谢谢回复！
结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了，hairpin stem有9个base pairs,
只有2个GC，Tm没测过，算出来的是54C，自由能也很低，因为序列开始是2个UU base
pair，可能不太稳定，但是从核磁上看UU base pair都形成了，所以感觉很矛盾。试过
端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对
照。 |
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p****s
发帖数: 3153 | 25 "The structure before folding", in the field of protein folding we don't
really have this concept...Or it is largely unimportant. Once the protein
nascent chain comes out ribosome, the folding has been already started.
Sure there are large families of proteins which are nativly unfolded. But
if you want to seek in vivo structure information, we just look at native
structure (the structure with the lowest overall or local energy) If you
want to study the unfolded structure (non native), you can u... 阅读全帖 |
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a****k
发帖数: 1130 | 26 可以做，不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。
如果你一定要用玻璃板，其实我们也试着把agarose配进PAGE里面，不过这样胶会比较
沉，很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶
还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的，所以我在想
或许是有什么secondery structure形成吧，比较你的probe也是经过gel purify的了，
应该不会有别的问题。还是换一个running system吧 |
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a********n
发帖数: 844 | 27 如果lz在讲附上的胶，我的看法是：
1.上面那个带是well里边滞留的，下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
曝光时间不够长。我做过无数EMSA，也是RNA aptamer，RNA 从MAXIscript得到后不用
纯化，直接取1 ul去跑denaturing gel，看看有没有transcripts，产量有可能因为变
化的，所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪，在这上面浪费了几个星期，一直以
为是这个那个仪器不好用。
2.lz提到protine minus也有多条带，这在native gel里边太正常了，因为RNA有多种
folding的可能性，即使mfold只给出一种结构，我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
性的带可能跟RNA一下带superimpose，但是你会看到下边一条带变弱，上面一条带变强
，这样你要换种浓度的胶跑跑。
3.制胶和电泳液可以用1/4xTBE或者1/2xTGB，前者我用的比较多，这个每个蛋白性质有
关，一般都要试试。
4.ARGA胶有些时候可以替代page，想B52的RNA APTAMER只能在ARGA胶才能看到shift，
原因不... 阅读全帖 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 28 这一步要WB和commasie同时跑
大多数inclusion body的蛋白在WB 上也会显现，这个没什么意义
要看在supernatant 中有多少
而且要充分离心，取真正的清液
办法， 降温，少加IPTG，等等
实在不行denature |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 有一个可能就是你那个全长的蛋白因为一些构象原因不能被pulldown,
反而是被切过的（或者alternatively splice) 的可以被pulldown.
如果你开始用的是native buffer pulldown 的话，不妨换成denaturing pulldown
condition
比方说用 2 %SDS 把细胞给煮了，然后加缓冲液稀释到0.2% SDS再pulldown,
这样一方面可以解决大部分构象原因，另外一方面也会减少背景
当然，如果你比较倒霉的话，这样也有可能导致你什么都pulldown 不下来。这个你得
试一试，就没有人敢给你保证了。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 30 How about sequence similarity between these domains?
Elisa, all domains are in soluble conformation. A's small region could
be folded inside.
In WB, all domains and proteins are denatured. If there are some highly
conserved region between B,C, and D, then I think you got an explanation.
A.
Full |
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a****o
发帖数: 1786 | 31 to check RNA, you should run a denature gel, either agarose+MOPS or
polyacralimide+urea. If your RNA intends to form no 2nd structure, it may
run at similar position as its DNA template. otherwise something is wrong.
Single strand DNA or RNA gives very low signal compared to the same size ds
DNA if you stain with EtBr. |
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m*****n
发帖数: 760 | 32 for fast examination, you could run your RNA samples on 2% TBE agrose gel.
for accurancy, you want to run them on denaturing PAGE gel. |
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m*********n
发帖数: 215 | 33 Your RNA forms secondary structure. that's why the guy upstairs told you to
run it on a DENATURE gel to kill the secondary structure..... |
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f*******e
发帖数: 628 | 34 实在是要跑一般的胶的话，要在 formamide 里面 heat denature，然后snap cool 到
冰上，马上跑胶。不过里面 DNA 会出 double band。 |
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j****g
发帖数: 406 | 35 Depending on which company you use, you might not need to do that.
I purified my proteins in denatured condition and the company it is fine for
injection. So I just sent them the protein in 8M urea.
And I got quite good antibodies.
The problem is if you are going to affinity purify your antibody.
If you are, then you will need to get protein in native condition.
In my case, I lowered the IPTG concentration and lowered the temperature for
induction and only got a tiny amount of protein.
But that ... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 我是觉得把可溶的也denature比较不可思议
至于包涵体
我觉得很有可能大量表达的时候在细胞里就是局部浓度超级高的
不管后面提纯的时候蛋白表现出来的是可溶还是不可溶
很多时候发现蛋白不可溶
然后就归结为包涵体的有点太笼统的
很多情况下其实跟如何破碎细胞
还有是如何提纯的有很大关系
我就遇到过多次普通protocol下破细胞后不可溶的蛋白（离心后在沉淀里）
换别的提纯方法最后发现其实是可溶的（在上清里）
push |
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e****s
发帖数: 1125 | 37 乱猜一下，感觉这个更像是蛋白在Beads上Denature了。
你说的“最后Beads fraction”是用SDS之类的变形溶液洗下来的吗？还是GSH洗下来的
？都被Thrombin切开了（有没有试过GST elute下来以后再切？我猜你是在Beads上切的
）？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 38 额，为什么会denature呢？
最后跑胶用的那个beads就是直接吸出来的，是在pbs里的。
至少95％被切开了。
我没有试过先用reduced GSH先洗，然后在solution里切过，我明儿个试试。
谢谢。 |
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o********y
发帖数: 87 | 39 Run denaturing agarose gel |
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o*****r
发帖数: 156 | 40 For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein. |
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F*******2
发帖数: 103 | 41 I accidentally put my protein solution (a membrane protein) at RM for
overnight. I was worried if some of the proteins have already gone bad.
Could I separate the "bad" proteins from good ones and how? |
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a***e
发帖数: 1010 | 42 depends how you do SNP mapping after that.
for us, just digest sample with proteinase K, then denature proteinase K,
then PCR, then restriction digestion. that's good enough. |
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b******n
发帖数: 4225 | 43 denatured plasmid which is resistant to enzymatical digestion
it's due to long time treatment of solution II(NaOH/SDS)
没有切过。最左边的是ladder，然后从左到右依次是冻在-20度的，藏在4度的和丢在室
温的。过了五天拿出来电泳，看看降解得怎么样了。如大家所见，最左边的条带（-20
度）看上去挺好，超螺旋 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 44 PAGE纯化的都不靠谱，最好是HPLC纯化的
pnk加磷酸不如直接合成带5'磷酸的oligo
这样基本上万无一失了，就是有点贵。
想省钱的还是合成2条primer故意让它们形成primer之间的dimer
PCR后酶切，跑个10%的non-denatured的PAGE，切胶后碾碎，用TE泡1小时或过夜，乙醇
沉淀，记得加点离子。
HPSF |
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f*******e
发帖数: 354 | 45 做了个flag-tag fusion protein，在293 transient transfection, 用蛋白本身的抗
体检测是一大坨，q-pcr 表达也是有几十倍的升高。
但是就是用M2 beads IP不下来或者极少。
然后用flag 抗体检测，居然多次检测不到。最后是在疯狂一下地翻了10倍的二抗量 膜
都要压爆了才压出来条带正确的带，大小正确，量也与基因本身的抗体显示的量对应。
这在本实验室在293瞬转检测中似乎从来没有遇到过。
难道是flag跟我的蛋白在一起就难以检测？ 甚至在denature gel中？
那在nature状态下更难结合？所以IP失败？
求教，
非常感谢 |
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o*****r
发帖数: 156 | 46 One thing you can check is to denature the protein (8M urea) to see if it
binds to the Ni column. If it does, the his-tag is buried and un-accessable
in the native state so you need a bigger tag/longer tail. If it still doesn'
t, something else is going on. |
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y******8
发帖数: 1764 | 47 Purify under denaturing condition and renature the full length protein. |
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a********k
发帖数: 2273 | 48 PAGE用denature的，可以看SNP，以前做mapping的人用SNP做marker就是这么跑的
现在的qPCR仪都有HRM功能，也可以看SNP |
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b******y
发帖数: 627 | 49 Don't recommend denature-renature from inclusion body. Not many successful
examples, especially for relatively large proteins. You will have better
chances if putting a good tag, (MBP, Sumo, GB1, .... even GST) in front of
your proteins. |
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s******a
发帖数: 472 | 50 谢谢，有道理。
如果质粒热变性容易复原，能通过增加initial denaturing的时间来改善PCR效率吗？ |
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