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p****y
发帖数: 95 | 2 PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a.... 阅读全帖 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 3 我不知道这个几个方法对你可行不，1. 将你的蛋白和不同浓度的standard比如BSA一起
跑胶然后silver stain. 之后用一般
胶stain的quantitation method 来粗略定量。 2. 将你的蛋白dialyze 到底盐或者
dh2o里。 lyophilize 成powder然后从
新溶解到small volume的buffer里来提高浓度再定量。 |
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d******u
发帖数: 178 | 4 cDNA (from 2ug total RNA): 5ul
10X Pfx buffer: 12.5ul
10mM dNTP: 3ul
50mM MgSO4: 2ul
Fwd primer (10uM): 2ul
Rev primer (10uM): 2ul
Platinum Pfx: 1ul
dH2O: 22.5ul
_______________________________
50ul/rxn
+10X enhancer: 5ul
PCR:
94C, 5min
__________
94C, 15sec
60C, 30sec
68C, 3min
__________35X
68C, 7min
4C, for ever
我用PrimerExpress设计引物，标准60度Tm。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 5 我现在用的protocol就是：
purified dna: 10ul (1ug)
dATP (10mM): 1ul
10x taq buffer: 5ul
MgCl2 (50mM): 1.5ul
Taq: 0.2
add dH2O up to 50ul
72 degree for 20min
我没理解你最后说的意思。
你是说用phusion做完纯化最后一步用稀释的Taq buffer洗？
谢谢。 |
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n******d
发帖数: 680 | 6 没有觉得阿，上周刚在楼下的facility测了两个PCR片段，一个700bp一个450bp，单引
物测序，结果都非常不错的阿。
我只用了Qiagen的kit做了一次胶回收纯化，然后用30 ul的dH2O洗脱，最后用乙醇浓缩
了一下下。因为我这里的测序的要求是，PCR产物浓度应该达到10ng/ul。 |
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