K******S
发帖数: 10109 | 1 very fishy ah. The timing is prefect for O8. And CNN said his body was
buried at sea.......
I thought he was dead long time ago. (severe kidney disease that needs
dialysis everyday) |
|
l********b
发帖数: 6 | 2 He meaned you don't have to add glycerol at all if you find it does not hurt
the protein property. If you know it is an enzyme, I think you had better add
glycerol, because freezing and thawing cycle can kill the enzyme. For other
proteins, I do not bother to add glycerol either.
And to get rid of gluathione, besides dialysis, there is an easy way. Take a
spin-column with an appropriate cut-off filter, e.g. 30KD, spin, concentrate
the protein and get rid of the solvent in the meanwhile. Then add |
|
p*******i
发帖数: 449 | 3 用分子筛柱脱盐 没必要透析那么复杂 用低盐缓冲液走一遍分子筛应该就差不多了
猜测你的蛋白用尿素之类的缓冲液做的纯化 所以关键不是用什么脱盐 是你的蛋白质由于
疏水性的问题必然不能达到你要的盐浓度
如果后续检测不影响的话 可以考虑用DMSO促溶
仅仅是点建议 以前做蛋白质的功夫快忘没了 |
|
I*****y
发帖数: 6402 | 4 I think it really depends on your buffer used for your IEX elution. I don't think a
sizing column is sensitive to salt.
If you still have concern with the salt from your IEX elution, just try
changing the buffer to low salt when you concentrate your proteins.
column |
|
k******e
发帖数: 8870 | 5 no, it won't affect the seperation |
|
s********l
发帖数: 1195 | 6 对，盐浓度对尺寸排组影响不大，但是要保证出来的东西没有杂质会堵凝胶，上样前最
好过滤一下。
column |
|
t****p
发帖数: 1504 | 7 不知道本版有没有人有抗体纯化的经验。
血清过抗原柱，用PH2.5的Glycine洗脱，最浓的几管fraction沉淀出来了（管子有加1M
Tris buffer），形成浑浊液，无法重新溶解 （调PH，加盐都无效）。
溶解问题不解决没办法dialysis，抗体放4度时间长了估计也有问题。哪位知道trick赶
快指点一下，包子相谢！ |
|
m**z
发帖数: 787 | 8 dialysis不就行了，干吗非要desalting column呢
desalting |
|
H*g
发帖数: 2333 | 9 Thanks for all the feedbacks!
Does Dialysis take too much time? I am just too lazy, since desalting column
seems easier. |
|
T*R
发帖数: 36302 | 10 现在的核心问题不是怎么延长生命，而是活得太长了政府没钱（纳税人）去养这些老人。
去医院或是养老院看看，8，90岁的老人一窝窝的，100岁的也不少。大部分药就是个苟
延残喘的作用。多活两年又怎么样？
OBAMA周二演讲说了，冻结政府支出5年，消减非必要支出。显然科研就属于非必要支出
之一。实际上现在很多实际措施已经瞄向了制药公司。
比如AMGEN的当家产品EPO。临床上用的最多的是DIALYSIS病人。原来对于HD和EPO这两
项主要支出，MEDICARE是分列报销的。
前几天和一个透析护士聊，她说现在MEDICARE政策改了，由HD和EPO共享一块馅饼。她
们透析部门就要消减人手降低成本，反过来，医生肯定也会少开EPO。钱就那么多，你
分多了我就没法活了。
这只是一个例子，以后这种情况越来越普遍。ILLINOIS州长本周刚签署法律，要求消减
开支，其中很大一块是瞄准州政府最大的开支MEDICAID。MEDICAID的处方药福利被消减
不少。
从09年1月O8上台到现在两年了，股票大盘上去了不少，DOW涨了50%，你再看看主要的制药股
，AMGEN，ABBOTT，MERCK，PFIZER... 阅读全帖 |
|
|
n***w
发帖数: 2405 | 12 I think you need to do dialysis. |
|
x*****o
发帖数: 441 | 13 一直对于从包涵体里面提纯蛋白感兴趣. 是不是这样做不好? 我们组里面提纯的蛋白就
算是可溶性的也用non native的方法纯化,就是6M Urea denature,然后ion exchange
FPLC, 然后再dialysis. 所以最后都用包涵体了.
是不是用ion exchange 必须denature阿? |
|
S*****s
发帖数: 287 | 14 我的 BAC 是 CsCl Purify 的，不过最后一步用 Pierce 的 dialysis cassette 对 TE
做透析，然后用离心柱缩小体积到 500 微升左右，浓度大概在 500 ng/ul 左右。如
果沉淀之后再融解浓度可以更高，不过容易把 DNA 搞断掉。 |
|
s****9
发帖数: 932 | 15 For an 50KD protein, there is no reason to keep GST. For some peptide
antigen (e.g. 50 peptides), you might consider keep GST in order to amply
the antibody responses.
For removing 20KD protein from 50KD proteins, the first portion I would
consider is 25KD-30KD dialysis.
和其他蛋白分开，进一步纯化？ |
|
c********b
发帖数: 363 | 16 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
|
c********b
发帖数: 363 | 17 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
|
h******g
发帖数: 600 | 18 【 以下文字转载自 Macromolecules 讨论区 】
发信人: hawkping (鹰平), 信区: Macromolecules
标 题: 请问：高分子纯化的ultrafiltration如何做？谢谢了。
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 18 13:26:32 2011, 美东)
文献上讲用ultrafiltration纯化，是不是需要特殊的仪器，还是跟dialysis一样？
谢谢了。 |
|
|
|
p**5
发帖数: 2544 | 21 Thanks, good to know.
My peptide is 26 AA long, but I still worry DTT may not be completely
removed. |
|
b******y
发帖数: 627 | 22 it should be ok. Or use bme instead, which is half of dtt. |
|
p**5
发帖数: 2544 | 23 没关系，在那里我看到1K的了，就是这个132103合适，16 foot length合适 |
|
p**5
发帖数: 2544 | 24 I want to use tcep, which is stabler and less buffer issues. |
|
e****e
发帖数: 1042 | 25 According to your opinion, I should use Bradford assay to determine total
protein and peptide. I will get the total amount of my peptide product from
HPLC. Then the protein amount is total protein and peptide minus the amount
of my peptide product. Dialysis is not necessary, right? |
|
e****e
发帖数: 1042 | 26 I already got what I need to know. My question is very simple. That is, is
there any method can measure only protein but no peptide without further
seperation or purification? I thought the answer should be "No" before I
came here. But I am not so sure since I never think about it before. When I
worked in purification labs, we always used OD280 to determine protein
concentration since the protein is quite pure. When I worked in molecular
biology lab, we always used Bradford to determine the pro... 阅读全帖 |
|
b******y
发帖数: 627 | 27 The C-terminus question was answered by onfire.
You are right that reducing agent is prohibited during reaction. However,
DTT or BME can be used to quench the reaction. The manufacture should have a
better protocol. However, neutral pH and room temperature should work. I
will do a small scale reaction, take a few time point, and run SDS-PAGE to
see when the reaction close to finish.
You can purify it using superdex peptide column from GE if needed. Otherwise
, just dialysis into pbs and inject. |
|
e****s
发帖数: 1125 | 28 加DTT或者TCEP有什么不好吗？
既然在DTT/TCEP的条件下稳定，就这么提啊。我们实验室提取蛋白一般Buffer都放1-
5mM DTT。如果DTT对下游试验会有干扰，用以前脱盐或者Dialysis就好了。 |
|
m**z
发帖数: 787 | 29 re.
Mg-binding UV不会有变化，intrinsic fluorescence值得一试。或者用能bind Mg的
fluoresent probe做competition titration.又或者equilibrium dialysis.ITC,NMR也
可以，但是不容易做，蛋白需要量也大。
还有一个值得一试的是：用Co先代替Mg作titration.Co binding通常伴随UV变化，然后
加Mg来compete with Co.这样数据分析也能得到Co/Mg binding constant. |
|
l******n
发帖数: 143 | 30 提供点俺的意见供你参考哈,希望不要介意中英文掺杂,有的东西英文描述简单些习惯些
(1)很多物理过程和化学过程都有热效应,比如说protein oligomerization including
protein aggregation.简单说,如果有检测到的热效应,不代表一定来源于你希望研究的
那个特异性反应.需要先排除其他情况才能做出推断.在ITC实验里,有的蛋白或者其他分
子很不适应被高速搅拌,所以有可能产生沉淀,这个过程混合在其他过程中,比如有热效
应的特意反应中,可能造成没有明显规律的信号.简单的方法是ITC titration后取出
cell里的溶液看有没有明显沉淀,跑个UV-Vis spec,如果明显340-320 nm的吸收值比以
前高,有可能有大分子形成.具体一些的操作,可以先把两个反应中的分子以及其混合物(
两种分子比例尽量保证反应饱和)进行简单分析,跑柱子/胶/高速分析离心;在ITC实验后
,在cell里的混合物(应该主要是两种分子的聚合物,如果确定反应达到饱和的话)取出进
行同样手段分析,跑柱子/胶/高速分析离心.SEC解析度比较低,但有大分子形成也能很快
检测出.... 阅读全帖 |
|
l******n
发帖数: 143 | 31 晕,俺太土了才看到你这个回帖.CO-IP有可能有artifact,in vivo其他分子有可能有辅
助效果.如果条件允许,最好做其他在溶液中的反应测试进行比较.
peptide如果是lyophylized powder有可能有其他分子进行干扰.有很低MWCO的dialysis
membrane,你可以尝试.ITC对buffer exchange要求高. |
|
C*********m
发帖数: 213 | 32 嗯，市面上能找到最小mwco的透析袋好像是1kDa, 估计我的peptide透析要损失60%以上
。这两个peptide表现不同可能是合成过程中的盐之类造成的。多谢。
dialysis |
|
|
i***l
发帖数: 1656 | 34 in your case,
1. target protein is degraded before chromatography
or
2. 6his affinity chromatography can not purify it well
dialysis does not help in both
to determine if #1==TRUE, western blot using target specific antibody
to improve #2, add one more chromatography (ion exchange, size exclusion,
etc) |
|
r******g
发帖数: 600 | 35 我就用碱法提啊，并且还挺好用呢~ 比如我上次screen了50个克隆，你想想，要是用
qiagen柱子，这一下就要花几十块，我用old school的方法，省了不少钱，也多花不了
多少时间~ 其实我也就是帮老板省点钱呢！
我一般是确定了clone以后，再用柱子来purify for sequencing
我们实验室，也从来不要gel extraction, 我也是用的old school dialysis tubing
purification的办法~ 挺好用的，只要实验work，什么办法都是好的！
其实用old school的办法，可以搞明白到底technique是怎么work 的啊，有问题的时候
，比较容易troubleshooting！ |
|
r******g
发帖数: 600 | 36 直接切下来在dialysis tubing里面跑个人胶就行了
我一直用的原始办法 很好用的 |
|
r******g
发帖数: 600 | 37 直接切下来在dialysis tubing里面跑个人胶就行了
我一直用的原始办法 很好用的 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 38 找个分子量的柱子，比如3k啥的，离心个半小时就好了。
或者dialysis换buffer以后冻干，直接冻盐浓度也大了 |
|
e****s
发帖数: 1125 | 39 这个问得有点太泛泛了。比如浓缩的目的是干什么？最关键，蛋白能否变性。
Amacon是好的浓缩纯蛋白的方法，对cell lysate不是太好。首先，有个分子量Cut的问
题，膜孔径的大小。其次，小蛋白本身就会丢失。自然你的recovery 不会高。
1.Salt cut，复溶后小心dialysis，去盐。蛋白还是活的。这么处理后，能否到80-90%
我也不知道。
2. methanol precipitation，蛋白应该是变性了的。
可能还有别的办法，期待大牛们讨论。
concentrate |
|
n********e
发帖数: 1630 | 40 yes. i did dialysis 500x twice to remove free labels. that's also what other
people do after labeling.
biotin |
|
e****y
发帖数: 129 | 41 不应该啊？我在octetred上用过超过20个protein，都很好。你说的很低是多低呢？1：
1的NHS-LS-biotin，PBS buffer，4 degree 2 hours，followed by 500mlx3 (2 hours
, 2 hours, and over night) dialysis to remove unreacted biotin.这个一定要去
干净，要不immobilization会很差，哪怕一点点，这个是小分子，比protein
immobilizationxiaolv高很多。
positive |
|
y****6
发帖数: 196 | 42 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azide modified oligo 反应
。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
|
t*******o
发帖数: 516 | 43 有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。 |
|
w*****8
发帖数: 193 | 44 谢谢你的建议。可是我切完后的蛋白是要长晶体的。不能dialysis到高盐里呀。所以我
的盐浓度只用了150mM。不过我切的时候蛋白浓度只有0.5mg/ml，就是怕溶解度不好沉
出来。我都trouble shooting很久了 |
|
H****s
发帖数: 301 | 45 你的蛋白是用FLAG多肽洗下来的吧，然后有没有做dialysis？如果蛋白样品里有大量的
FLAG多肽的话，你的抗FLAG多肽抗体没有机会去和蛋白上的FLAG结合。 |
|
发帖数: 1 | 46 Please consider the inhibition effects caused by high affinity unfunctional
metal cations that compete against the functional metal cations. So it's
important to do extensive dialysis after the NgAgo is purified by affinity
chromatography before one carries out the in vitro nuclease activity assay.
Never know what's going on really .
Han has to figure the reason quickly. If other labs figure it out before
they do, the credit will go to that lab.
: PfANgo cuts DNA, by using Mn and Co
: N... 阅读全帖 |
|
j***x
发帖数: 1469 | 47 Membrane longevity in peritoneal dialysis: impact of infection and bio-
incompatible solutions
N Topley - Advances in renal replacement therapy, 1998 - WB SAUNDERS COMPANY
please send to :[email protected]/* */
thx |
|
a***d
发帖数: 1998 | 48 Clin Nephrol. 2009 Nov;72(5):405-9.
A case of endocarditis of difficult diagnosis in dialysis: could "pest"
friends be involved?
Malek-Marín T1, Arenas MD, Perdiguero M, Salavert-Lleti M, Moledous A,
Cotilla E, Gil MT.
PMID: 19863886
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19863886 |
|
S*****a
发帖数: 63 | 49 【 以下文字转载自 Pharmaceutical 讨论区 】
发信人: Somalia (Anti-Pirates), 信区: Pharmaceutical
标 题: Biologics Discovery and Development Positions Available at Abpro Labs in Woburn, MA
关键字: Biologics,Discovery,Development,Antibody,Computational
发信站: BBS 未名空间站 (Wed May 31 20:28:52 2017, 美东)
Multiple Biologics Discovery and Development Positions Available at Abpro
Labs in Woburn, MA
www.abpro-labs.com
To apply please send resume to [email protected]
1. Scientist/Senior Scientist, Antibody Display Technology
... 阅读全帖 |
|
l**y
发帖数: 595 | 50 放进去1ml.取出来2ml,是不是水进到袋子里了 |
|
