e**r
发帖数: 1144 | 1 为什么沉淀在中间而不是溶解在有机相呢？
如果不用酚，只是改变Ph, dna会不会照样沉淀？
的DNA基本都没了。提DNA一定要用中性酚。 |
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s**x
发帖数: 138 | 2 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY没
有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
了。 有点伤自尊啦 。 |
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s**x
发帖数: 138 | 3 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY是
，没有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
了。 有点伤自尊啦 。 |
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c*********t
发帖数: 340 | 5 同卵双胞胎的DNA METHYLATION PATTERN不一定一样，多少有差的，因为环境多少不一样
现在做DNA METHYLATION的MICROARRAY那么多
跑一下DNA比对一下嘛：） |
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w*****n
发帖数: 107 | 6 * Use Sodium acetate (0.3M final conc, pH 5.2) for routine DNA
precipitations
* Use Sodium chloride (0,2M final conc) for DNA samples containing SDS
since NaCl keeps SDS soluble in 70% ethanol so it won’t precipitate with
the DNA.
* Use Lithium Chloride (0.8M final conc) for RNA. This is because 2.5-3
volumes of ethanol should be used for RNA precipitation and LiCl is more
soluble in ethanol than NaAc so will not precipitate, but beware - chloride
ions will inhibit protein synthesis |
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k*****o
发帖数: 1486 | 7 离心完倒的时候尽量倒干净.
稍微大点的DNA你只要vac一会儿就可以了,不要让它completely dry,反正你用的是70%
Ethanol,里面最先出来的都是ethanol,留下的那点儿都是纯水(如果你做70%Ethanol用
的是ddH2O的话).
基本所有对大DNA提取的protocol都是说不要蒸干.不过才16kb的话干了也无所谓,加水
静置overnight自己就融了,不行枪吹打两下就OK了.要是不溶的话就是你DNA提的不纯，
16kbDNA提出来应该很透明，一砣一砣的那些基本是蛋白。
为了看里面酒精是否全部蒸干,可以用直接鼻子上去闻,你可以闻出来有没有酒精的. |
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c******r
发帖数: 3778 | 8 。。。DNA变性？DNA变性又不影响酶切，也不影响PCR，只要不断就可以啊。反正一降
温不就重新anneal了吗？如果担心可以慢慢降温啊，比如放60度10分钟。不要95度然后
直接放冰上，那个会影响DNA的annealing。
不过加热好不好使我真的没直接试验过 |
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y******y
发帖数: 107 | 9 有一台超声仪 Branson Sonifier 450, 想把genomic DNA打断成100－500bp的片断，该
如何设置参数？DNA用多大的浓度比较合适？以前没有用过超声短DNA，所以不是很了解
，谢谢。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 10 哈哈，ld是老伴的简称啊，呵呵
哦，酱紫，那真的只有一个copy啊。。。试试楼上说的，nest三轮吧。别的真的没啥好
办法了。
另外，可以中间加个probe，用qPCR做个test，看看amplification efficiency。
你看，DNA的平均分子量是330g/mol，如果100bp的product，那么平均分子量是660g/
mol。agarose gel加EtBr，100ng的DNA应该可以detect了吧？那么100ng大概合10e11个
copy的DNA double strand分子。
咱们如果assume PCR的效率是100%，那么就是那么一个copy要amplify到10e11大概需要
37个cycles。。。
如果PCR效率比较差，比如只有50%，那么需要62个cycles，所以啊，你看，最好先测一
下你的amplification efficiency。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 11 我没做过chromatin，所以说得不对的话请大家批评。
我主要是做recombinant protein expression比较多，在我用的protocol里，lysate
sonicate之后，高速离心之前的一个步骤就是加4%的PEI (polyethyleneimine)到终浓
度为0.2%左右。这一步就是为了去除DNA的，我做过gel shift，PEI处理过的蛋白跑的
胶确实没有DNA，而不经PEI处理的蛋白就会有DNA contamination，区别还是很明显的
。我的lysis buffer里没有加DNase，貌似PEI的效果就很好了。
但是不知道PEI对你的样品和后续处理有没有影响，所以只是作为参考。 |
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m**z
发帖数: 787 | 12 PEI will precipitate the DNA and RNA, but it will precipitate the protein
associated with the nucleic acid as well. You can do this with 0.5 M or
higher NaCl, or wash the pellet afterwards, to decrease the protein-DNA
interaction, but some proteins will remain in the pellet.
In protein purification, this is a good step to get rid of nucleic acid, or
for purify a DNA binding proteins, etc... |
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c*****e
发帖数: 619 | 13 知道很多做FISH是用的，但是查文献，发现做GISH（genomic in stu hybridization)
有的用，有的不用。
到底用salmon sperm DNA的目的是什么？ 做GISH如果加了blocking DNA还需要加这个
salmon sperm DNA吗？ 多谢 |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 In fact, it opens up tons of questions/opportunity---in term of DNA. RNA and
Protein functions and regulation as well...so a next key question would be
whether it is just an evolution accident or it has wider implication, e.g:
it ever happens in other organism such as human, do As ever get into our DNA
/RNA/protein and play any functional/regulatory roles?
BTW, u are too greedy...if it doesn't need this DNA stuff, it would be an
instant nobel....However, I always think everything is possible, ... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 我觉得前面有个谁说的对，这个生物本来就很有趣，
但是如果有普遍性就更有趣了。比如mice在砷中毒以后
DNA里面是不是也有砷了，这条DNA是不是也能稳定遗传？
DNA是不是突变增加了？是不是调控发生改变，等等。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 所以大家就看出了你不是学生物的。呵呵。磷作为能量分子什么的，可以省，
但是作为DNA, RNA这些分子的基本骨架，是没有办法省的。
生物在每繁殖一次，就必须复制一次DNA,而且做出一堆RNA, 所以这个磷肯定要
每次都用的。不是你想省就能省的。
所以他们的解释是砷代替了磷，这个解释还是合理的。
另外，大部分生物里面的磷元素的含量是有一个底线的。因为DNA必须有一定长度
才能编出足够数量的蛋白。而每个蛋白本身都必须有一个mRNA和它对应，再加上
所有必须的tRNA, 和ribosome里面的一大堆rRNA, 这个磷的含量可不低！
mass？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 17 没有看他们的paper，如果是砷骨架的DNA，那里面的各种元素比例应该能测出来吧。
所以大家就看出了你不是学生物的。呵呵。磷作为能量分子什么的，可以省，
但是作为DNA, RNA这些分子的基本骨架，是没有办法省的。
生物在每繁殖一次，就必须复制一次DNA,而且做出一堆RNA, 所以这个磷肯定要
每次都用的。不是你想省就能省的。
所以他们的解释是砷代替了磷，这个解释还是合理的。
mass？ |
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S******G
发帖数: 965 | 18 "复制一次DNA,而且做出一堆RNA"
师妹你这个陈述能量化吗？我的疑问的根本是：并不是所有的繁殖都需要一样多的DNA
，我猜想一般细胞里面的dna的copy是有多余的，复制出来的RNA也有多余的， 这个繁殖的turnover的速度肯定也是不一样的。 |
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f******s
发帖数: 288 | 19 合成dna，rna的时候，它们可不是像催化剂，是聚合酶起到催化剂的作用，dna或rna是
反应底物／产物。
不过，从化学反应角度想，一切都取决于能量，酶的作用就是拉近反应基团，降低能级
，所以到底是什么使细菌里的各种酶能够无障碍的识别砷，是个问题。但是再想想，其
实对酶来说，真正识别反应基团的 amino acid residue 就那么几个。细菌本身的
adpation快， 或者说是mutation 速度快。比如砷最开始的可能就是某一两位置上取代
了磷，如果又没有特定的修复机制，就会保存下去，会加速整个系统突变的过程。不用
产生新的酶，只要原有酶上的某个关键位点改变了，这样突变的过程会无限制的扩大下
去。如果是做酶的，这个根dna damage 的研究路线可以很相似的。
而且，看了这个我都想回去继续做我的polymerase了，人工合成些dntp，在a,b,r位置
放上砷，然后把进化线上的各种细菌，真菌，哺乳动物的酶都拿来试试，看看谁可以合
成，合成到什么程度，说不准低级的可以，到某高一级上发现就不可以了，然后就再找
哪个位点最重要，不用很大工作量，很容易出paper呀，呵呵。
这... 阅读全帖 |
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e*****n
发帖数: 15 | 20 已经有了whole genome的DNA，要送去测序，测序那边说我要给他们300bp的DNA
fragment, 这样他们才能做library
看了别人，都是sonication来得到DNA fragment的了
可是要怎样的conditions才能得到300bp的呢？
多谢板上大侠指导 |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 你到底是用DNA pull啥？只要DNA，多长都可以，不过毫无意义。
要pull蛋白，20bp估计太小了吧？要pull其他的DNA，20bp不够
牢，一般用LNA,PNA一类的 |
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Y*Z
发帖数: 1301 | 22 本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
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a*****a
发帖数: 32 | 23 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
万分感谢！ |
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R****n
发帖数: 708 | 24 If memory serves me correctly, kits usually use either beads or spin column
to capture the modified DNA strands.
Is your DNA come from cell or clinical sample? You can wash modified DNA
with TE buffer or your kit buffer a couples of more times to make sure
templates clean. Sometime I did have strange melting curves from clinical samples due to inpurities from biofluids. Or you can dilute your templates to see if there is any change.Even sub-nanogram concentration should work.
From your descri... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 25 一端是2'F RNA，另一端是DNA，splint template是DNA，这样DNA ligase会
work吗？呵呵 |
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R******d
发帖数: 1436 | 26 这两者之间存在相关性是吧。请问是histone modification决定/指导underlying DNA
methylation多一些，还是反过来？
再请问一句，有没有报道全基因组rest T4 cell的DNA methylation profiling?
zhao keji 做了rest T4 cell的histone modification，nucleosome occupancy，好像
没有做DNA methylation profiling？
多谢了。 |
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z*t
发帖数: 863 | 27 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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z*t
发帖数: 863 | 28 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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g*********d
发帖数: 233 | 29 《Cell》文献翻译:基因表达的小RNA调节因子
Cell 134, 899 – 902, September 19, 2008
Joel R. Neilson and Philip A. Sharp
今年Lasker基金会承认了Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe在推断
小RNA分子在真核基因表达的转录后调节中所进行的开创性工作。
分子生物学是一门年轻的学科，如同充满了未开发土地的新大陆。有关小RNA在基
因调节中的作用的重要发现是这门年轻学科中还有许多未开发的重要领域的一个例证。
9月26日，几位先驱（麻州大学医学院的Victor Ambros、麻州总医院和哈佛大学医学院
的Gary Ruvkun和剑桥大学的David Bulcombe有关小RNA的发现将被授予2008年Albert
Lasker基础医学研究奖。
历史上先驱者以及他们的发现的意义通常被忽略，只是在很多年之后才被承认。
Ambros和Ruvkun所发表的描述第一个微RNA及其标靶的优秀论文（发表在高深的Cell杂
志上）被忽略了近10年。与此同时，... 阅读全帖 |
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m****M
发帖数: 360 | 30 有哪位做过抗体和DNA conjugate的？crosslinker是什么？最多能连多长的DNA/oligo/
primer （i.e.双链,单链都可以）。连后是怎么分离没有连上的DNA，要保持抗体仍然
具有结合抗原的能力。非常感谢 |
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b***g
发帖数: 516 | 31 请问大家都是用什么方法来从组织从提取DNA的？我想用illumina的系统做，老鼠的low
density panel，请问一般的kit提的DNA（比如QIAGEN的DNeasy Blood&Tissue) 够纯
不？纯度是不是A260/A280>1.8就够了？大概需要多少量的DNA够呢？
求大侠赐教，谢谢了！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 32 单从参数上看，这个PfuUltra DNA Polymerase相比Phusion High-Fidelity DNA
Polymerase，还是差了一个档次
没用过PfuUltra，但是Phusion很靠谱
DNA |
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s******y
发帖数: 220 | 33 我用的旧的也是invitrogen的，很好用，换了就不行了：（
我这个pcr 优化好久了，不想花太大力气，搞成纯种了没准就能用简单dna extraction
protocol了。
用麻烦方法提出的dna跑带很清晰，用简单方法提的dna跑就是smear：（
谢谢老鼠女王～ |
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q****2
发帖数: 208 | 34 按我得经验 减半没啥问题 或者你可以单独再去买Salmon Sperm DNA /Protein A
Agarose beads。
Salmon Sperm DNA /Protein A Agarose-50% Slurry就是50％的beads 50％ buffer（
其中包含了一定浓度的Salmon Sperm DNA） |
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F*****e
发帖数: 182 | 35 我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
段？多谢！ |
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l*******g
发帖数: 118 | 36 用限制性内切酶ScaI linearlized的质粒DNA，大概有4000个碱基对。
理论上的长度应该是4000*0.34nm=1.36um
但我在显微镜(AFM)下观察到的DNA部分在2.5um左右，基本上是理论长度的两倍。
这有没有可能是两个DNA分子连在了一起？ |
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f*******e
发帖数: 628 | 37 DNA 怎么在表面上 elongate 的? 看到的 DNA 部分是什么样的？算的是 contour
length 么？是所有的 DNA 都这样 还是就看到这么一个？
buffer 是什么？image dry 还是 wet? |
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A******d
发帖数: 571 | 38 想要做DNA 跑胶表明DNA 在apoptosis过程中被降解，请问有哪个kit提DNA适合这个目
的？
谢谢！ |
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p******6
发帖数: 410 | 39 最近要弄些临床标本提DNA做array-CGH.有些case只有用过的FISH slides available,
有高手能指教一下这些能用来提DNA做CGH吗？FISH probes所在区域我们分析时会考虑
进去的。这些片子当初都denature过，不知道这种变性后单链的DNA好不好提取？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 40 COLD-PCR then Agarose Gel electrophoresis
Abstract
The detection of low-abundance DNA variants or mutations is of particular interest to medical diagnostics,
individualized patient treatment and cancer prognosis; however, detection sensitivity for low-abundance
variants is a pronounced limitation of most currently available molecular assays. We have recently
developed coamplification at lower denaturation temperature-PCR (COLD-PCR) to resolve this limitation.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles... 阅读全帖 |
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f*******g
发帖数: 79 | 41 有RNA到DNA的逆转录过程， 有些细胞中DNA发生变法，有一些保持不变。 难道一个人
体内各个细胞的DNA还是有细微差别的？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 介绍两个好东西，那是相当的方便啊，做分子实验不可或缺
Qiagen有一种很好用的柱子，叫做minElute，elution体积10ul.
可几乎所有的resin柱子一样的protocol。
如果你DNA量比较大，millipore有一种size filter的的小柱
子，你选个10,000MW cutoff的柱子，普通离心把小分子和多数
水分离掉，然后倒过来放在Epp管里离一下把浓缩的蛋白、dna/
RNA, whatever回收就行了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 在我的印象中，在in vitro情况下，在不改变糖基上的结构（就是是否脱氧核糖）的时
候，把U 换成 T 是可以的，大致结构还是能够维持的。
在体内情况下，如果DNA里出现U,会被糖基化酶把那个地方切掉（修复的第一步）。
在RNA 里如果出现T会怎么样？这个我还真的不知道。谁来讲讲？
从生化上来讲，U 不如T 稳定，而且C 有时候会脱氨而变成U, 所以在DNA 里选择用T而
不是U的话有利于在长期储存里保存信息的保真度。不知道这个是否进化压力选择了T作
为DNA单位的原因。 |
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b*******a
发帖数: 62 | 44 最近在准备Chip DNA送测序，size什么的都没问题，唯一的问题就是DNA的
concentration太低，请问各位大虾如何提高chip DNA的产量？最关键的步骤是什么？
谢谢！ |
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a******s
发帖数: 267 | 45 高温烘烤确实不能完全摧毁DNA，但是这些DNA片段又经过胃肠消化酶的降解，进入血液
循环系统，再神奇的联入人体细胞基因组，然后那个幸运的细胞又因此大量分裂，产生
足以识别的病理症状。这要发生多少奇迹才行啊。
而且市场化的转基因产品，比如说那个来自稗草的草甘膦不敏感型QB蛋白基因，和大豆
原生的普通QB蛋白基因就差一个碱基，你就算把那个DNA片段纯化出来当饭吃有能怎么
样呢？ |
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w*****y
发帖数: 1201 | 46 我只说外源DNA片段有没有可能被人吸收，并没有说，外源DNA一定会导致突变。
这个外源DNA片段未必一定就是我们吃的食物中直接的，我们吃的食物中存在大量的微
生物，如果这些微生物中携带了一些转基因的片段，更是不能完全被胃肠中的消化酶降
解。人在刚出生时，肠道中基本上是没有微生物的，肠道中微生物的群落是通过后天摄
食的过程不断建立起来的，肠道细菌与人形成共生关系，在长期的进化过程中是否可能
产生基因的交换，都是存在这种可能的。 |
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a******s
发帖数: 267 | 47 可是这和转基因食品到底有什么关系？对人体来说，甭管食物是不是转不转基因的，里
面的DNA都是外源的啊。你每天不知把多少来自植物，动物，细菌，真菌和病毒的外源
DNA吞进了肚子里头，为什么就要死揪着转基因食品里面的几个外源DNA片段不放呢？ |
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l********k
发帖数: 14844 | 48 我把在这0.0001斤的细菌中的dna换成流感病毒、hiv病毒、霍乱、天花的部分片段，你
敢吃么？放心，我不会强迫你生吃。你爱炒就炒，爱做烧牛肉就烧牛肉，我不管。但是
外源dna片段我选，好不好？反正活细胞第一关加热就过不去，dna就算撑过加热，也过
不去胃肠里的酶，是不是？
段。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 50 你到底在说什么？说的是人uptake（其实是incorporate）外源性的食物DNA到人的
genome里面，还是细菌uptake人的食物里面的某些DNA片段？
你前面说cooking没有完全破坏DNA。。。完整基因基本没有了，但是没错基因片段是有
的。但是你知道这些片段都是不functional的。你做这么多knockout这是常识吧。然后
你推理出因此人可能会把大米转的基因加入人细胞。俺们告诉你不可能。
然后你接着反驳说病毒会加入人体。没错啊，可是大米怎么改良转基因也不是病毒。
然后你说细菌跟细菌间可以转基因。也没错啊，可是大米有不跟细菌转基因，人也不跟
细菌大米转基因。跟吃大米有什么关系？
然后你说菌群很重要，会拉肚子。也没错啊，可是转基因大米又不改变菌群基因。。。
你到底在说什么？能不能clearly define一下你的观点？ |
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