k****n
发帖数: 158 | 1 从 clontech pIRES2-DsRed 里 扩增 Dsred 出来，粘端连接到pcdna4里目标基因后面
，目标基因和Dsred有3个氨基酸连接，inframe 没有问题，测序后序列也没有问题。
但是转染细胞后没有红色荧光，自己想到可能的问题是：dsRED 是一个四聚体蛋白，可
能由于目标基因和Dsred之间的linker只有3个氨基酸所以Dsred不能形成四聚体，因此
没有红色荧光。
请各位帮我看看，我的想法对不对，还有什么别的问题吗？ 非常感谢，有没有什么好
的单体的红色荧光蛋白推荐？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 2 我用的是DsRed-Expression2
信号不阴不阳的，想用antibody验证一下
clontech自己卖的DsRed antibody不能做IF
santacruz零碎有一些，不知道哪几个好用？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 3 DsRed……
如果是做fusion这个蛋白尽量还是不要去沾
因为这个蛋白需要形成tetramer才能正常emit
如果所在的微环境不适合tetramer形成你很难看到一大片荧光
做定位的话也不可靠
另外DsRed-Express的荧光强度只有EGFP的58%左右 |
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b******n
发帖数: 4225 | 4 DSRed好像经常有这种问题
空质粒可以有红色荧光
一旦跟别的蛋白做成融合蛋白就无法产生红色荧光了 |
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s******9
发帖数: 283 | 5 我的DsRed fusion的maturation time也很长。mcherry要好很多。 |
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g*****e
发帖数: 209 | 6 这个花的时间更久吧
还不如western呢，找个dsred的antibody试试 |
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c**********n
发帖数: 147 | 7 我们实验室用的就是clontech的anti-dsred, 做frozen section的immunostaining很好
用啊 |
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i*****i
发帖数: 154 | 8 From clontech:
DsRed-Express is a rapidly maturing variant of Discosoma sp. red fluorescent
protein (DsRed). DsRed-Express fluorescent protein has enhanced solubility,
reduced green emission, and faster maturation than the original DsRed.
Although it is likely to have a tetrameric, DsRed-Express fluorescent
protein displays a reduced tendency to aggregate (1).
DsRed-Express2 fluorescent protein has even higher solubility, and was
designed for whole-cell and stem cell applications (2).
DsRed-Expr... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 下面第二句，为什么这是个advantage? 看起来非常糟糕啊，说明在488和550左右都能
被激发
或者blue laser和green laser有别的意思？
DsRed-Express2 has additional advantages. It is excited efficiently
by both blue and green lasers that are routinely used in
flow cytometers. In bacteria, DsRed-Express2 is expressed from the
endogenous start codon much more strongly than DsRed-Express
(Supplementary Fig. 4). Another important property is phototoxicity,
which has only rarely been measured for engineered
fluorescent proteins. Our results indicate th... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 10 对于荧光蛋白来说，如果要做fusion，最值得考虑的是三点
1）颜色
2）发光形式是多聚还是单体。最好是单体，比如EGFP，AcGFP, mCherry，mStrawberry。
DsRed，ZsGreen等等都是臭名昭著的tetramer，做了fusion之后经常一个皿中没几个发
光的，这种发光的细胞往往对于研究是无效的（这种定位不可靠）
3）relative brightness。如果以EGFP为100，那么GFP(48)，AcGFP(82),mCherry(47)
mStrawberry(78), DsRed(176),DsRed-Express T1(58)，DsRed-Monomer(10),Zsgreen(
117)
相对而言，别的参数大部分都是浮云
如果不做fusion，尽可以选择那些相对发光强度大的比如DsRed,Zsgreen |
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发帖数: 1 | 13 无意中看到一个老外写的，用了下面这篇文章里边介绍的使用荧光标签检控mitophagy。
Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy
DOI: 10.4161/auto.24001
FP-based biosensors for mitophagy
The field of FP engineering is accelerating with a plethora of new variants
described each year. These proteins show differen- tial properties, many of
which may provide useful tools to study mitophagy. For example, FP-based
biosensors such as a pH- sensitive mitochondrial-targeted FP chimera has
been recently developed to m... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 14 无意中看到一个老外写的，用了下面这篇文章里边介绍的使用荧光标签检控mitophagy。
Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy
DOI: 10.4161/auto.24001
FP-based biosensors for mitophagy
The field of FP engineering is accelerating with a plethora of new variants
described each year. These proteins show differen- tial properties, many of
which may provide useful tools to study mitophagy. For example, FP-based
biosensors such as a pH- sensitive mitochondrial-targeted FP chimera has
been recently developed to m... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 628 | 15 DsRed 的 spectra 看上去 excitation 的确很 broad, 具体取决于你用的显微镜的
blue 和 green 的波段定义，但 DsRed 在一般蓝光绿光 490nm, 515nm 的地方都有不
是太弱的激发，是最大的 40% 和 70%，信号强的话完全可以引起足够观察到的信号。
然后你们那里的荧光显微镜 emission filter 可能用的是 long pass filter, 就是说
，只要 emission 比允许的 wavelength 更长就都能通过。通俗的说就是 DsRed 的红
光 emission 可以通过为了蓝光或者绿光设立的 emission filter (如果是 long pass
而不是 band pass 的话），从而被检测到。如果不是有多个 color 看 correlation
的话，问题不大。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 16 如果你使用的是一般的laser scanning confocal的话，根据laser source的不同，有
几种固定波长的laser，可以选择。即使不是正好在所谓的maximum上，前后一定范围内
的也是很好用的。488nm既可以激发GFP，也可以很好的激发YFP。你可以设置搜集的
emission的波长，尤其是有两种颜色的荧光的时候。
mRFP和mCherry等都是从最早的DsRed改造过来的。m代表他们大多是单体（我印象里是
这样的），因为dsRed很容易形成四聚体。但是经过改造之后，excitation和emission
都有所变化。但是基本上580nm/610nm都可以很好用。mCherry荧光强度最高，但是mRFP
也很不错。
怎么查？google就可以了。虽然mRFP有很多突变体，Q66M或者是你的Q66T等，主要是促
进了蛋白折叠成熟，用580nm/610nm应该没问题。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 1， 用imagin J设置scale bar for Zeiss observer.A1的各项参数在哪里找？ 很多牌
子的scale bar设置需要的参数在网上都能找到，就Zeiss的找不到
2，小弟用的红色荧光reporter是DsRed，在red channel下看很specific,形态很好，但
问题是在 blue和green channel下看也很明显。
后来问了管理员说这台显微镜的filter 就是不太行，听起来很安慰，但还是很难被
convince，想请教一下这个情况正常么？ (这个DsRed是knock-in到一个endogenous 启
动子下面的所以是弱信号，要不也不会这么纠结了) |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 顶上去继续收集DsREd 的reputation
另外，有人用过DsRed expression2这个东西么？》 |
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h******y
发帖数: 1374 | 19 搭车问假设有这样一个构造EF1a-gene X-IRES-DsRed, 理论上讲一个subpopulation的
DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 是的，mCherry是DsRED衍生出来， 但是有的地方被修改过所以和eGFP 有相似性。
DsRED |
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s******y
发帖数: 28562 | 21 是的，mCherry是DsRED衍生出来， 但是有的地方被修改过所以和eGFP 有相似性。
DsRED |
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s*****V
发帖数: 21731 | 22 2008年度诺贝尔化学奖得主为日本科学家下村修(OsamuShimomura)、美国科学家马丁&
amp;middot;查尔菲(MartinChalfie)和美籍华裔科学家钱永健(RogerY.Tsien)三人，他
们因“发现并发展了绿色荧光蛋白(GFP)”而共同分享了这一殊荣。
无疑，获奖的三人是当之无愧的，但对于这样一个慧及人生的项目，有两个曾在过
程中起到关键的奠基作用的人却被遗忘了。
本年度诺贝尔化学奖实际围绕荧光蛋白展开，这是一种可以发出萤光的蛋白质，日
本科学家下村修发现了绿荧光蛋白，俄罗斯的卢基扬诺夫在此基础上通过珊瑚又发现了
红色荧光蛋白(DsRed)，美国科学家道格拉斯·普莱舍(DouglasPrasher)第
一个认识到GFP可以被应用在细胞生物学中，即通过给蛋白质染色从而可以观察生物体
中各类蛋白的运动和分布。
他开始倾力研究，但在提取了编码绿色荧光蛋白的基因序列后，因为申请研究资金
未果，从而放弃了再前进一步将基因放到其他生物体内看到荧光的试验。后来查尔菲和
钱永健听说了他的工作，向他寻求绿色荧光蛋白... 阅读全帖 |
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q****n
发帖数: 8 | 23 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: wonewbee (wo newbee), 信区: Biology
标 题: Re: 中科院神经所2012年年会蒲慕明所长的讲话
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 24 12:27:24 2013, 美东)
另一个危害就是data模糊外加选择性解读，最近的一个真事：
ucsd jin yishi lab 2009年的cell paper (汗，一座还是个中国人）；这个工作后面
有两个postdoc 和一个graduate分别开展不同方向的研究。几年来都米有进展（害人呀
！）。都发现以前的结果很难清晰再现（至少不象发表的那么黑白分明）。有一个苦逼
薄厚花了一年多时间仔细重复，还是不行。最后把一座嫩回来再重复。结论是当初用的
DsRed有非特异性，换成gfp后就没有任何区别了。当初结论完全不支持！
据说jin yishi很 “严肃” 的结论就是以后要用 gfp! 不知对这个cell paper, 这个
结论有没有后话了！ 呵呵。
老圃的话，看来还是 老虎，苍蝇还是要一起打。你说老板心里不明白吗？ |
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o*****c
发帖数: 94 | 24 好COOL的美女!10分!MM给我也打个分吧!谢谢啦!
在 dsred (青春做伴好还乡) 的大作中提到: 】 |
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s*****V
发帖数: 21731 | 25 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: saturnV (土星五号), 信区: Military
标 题: 体制问题，天才科学家穷困潦倒学霸得奖
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 23 12:17:28 2012, 美东)
2008年度诺贝尔化学奖得主为日本科学家下村修(OsamuShimomura)、美国科学家马丁&
amp;middot;查尔菲(MartinChalfie)和美籍华裔科学家钱永健(RogerY.Tsien)三人，他
们因“发现并发展了绿色荧光蛋白(GFP)”而共同分享了这一殊荣。
无疑，获奖的三人是当之无愧的，但对于这样一个慧及人生的项目，有两个曾在过
程中起到关键的奠基作用的人却被遗忘了。
本年度诺贝尔化学奖实际围绕荧光蛋白展开，这是一种可以发出萤光的蛋白质，日
本科学家下村修发现了绿荧光蛋白，俄罗斯的卢基扬诺夫在此基础上通过珊瑚又发现了
红色荧光蛋白(DsRed)，美国科学家道格拉斯·普莱舍(DouglasPrasher)第
一个认识到GFP可以被应用在细胞生物学中，即通过... 阅读全帖 |
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H*******g
发帖数: 6997 | 26 ☆─────────────────────────────────────☆
trymitbbs (charging~~) 于 (Tue Sep 25 12:35:06 2012, 美东) 提到:
是女多(适龄的，好的？)男的少？
还是缺乏认识的机会？
☆─────────────────────────────────────☆
downspring (田野里的旋风) 于 (Tue Sep 25 13:10:27 2012, 美东) 提到:
我观察主要五种原因：
1.刚来湾区，不清楚状况，找不到单身圈子的门路
2.太内向，在单身圈子混几次发现交不到朋友，难以融入，轻易放弃的
3.眼光高，看不上别人
4.在单身圈子实在混不下去，原因你懂的。。。
5.闲着没事，试试鹊桥呗，不征白不征
☆─────────────────────────────────────☆
LVHuan (.......) 于 (Tue Sep 25 13:30:12 2012, 美东) 提到:
zan !
☆────────────────────────────────────... 阅读全帖 |
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H*******g
发帖数: 6997 | 27 ☆─────────────────────────────────────☆
trymitbbs (charging~~) 于 (Tue Sep 25 12:35:06 2012, 美东) 提到:
是女多(适龄的，好的？)男的少？
还是缺乏认识的机会？
☆─────────────────────────────────────☆
downspring (田野里的旋风) 于 (Tue Sep 25 13:10:27 2012, 美东) 提到:
我观察主要五种原因：
1.刚来湾区，不清楚状况，找不到单身圈子的门路
2.太内向，在单身圈子混几次发现交不到朋友，难以融入，轻易放弃的
3.眼光高，看不上别人
4.在单身圈子实在混不下去，原因你懂的。。。
5.闲着没事，试试鹊桥呗，不征白不征
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LVHuan (.......) 于 (Tue Sep 25 13:30:12 2012, 美东) 提到:
zan !
☆────────────────────────────────────... 阅读全帖 |
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M********y
发帖数: 55 | 28 目前已发68个包子，以下ID请查收：
A: achie aily Akira amenity anywhere apie
B: barra
C: caf carolfu casio catous cccsss cher ChinaFirefly colorsofwin cozofu
D: daoruaimi die drew dsred
E： ECDT Eeyore EvaLuna
F: f6585 fallingwind features FLOGER foreveryoung fornothing
G: gosh
H: happyjerry htd
I: iamnumberone Inandout
K: kittysweetie KtownGirl
L: Lilywind lolo lovingblue luckie
M: matlabv7 mey moviefan
N： NeuLeben nvjish |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 这个实验其实不是很难做。其实是非常常用的手段之一。你们可以随便查查别人
怎么做的，心里就有数了。
一般来说，就是把癌细胞打到皮下，然后过了几个星期之后，把老鼠杀了之后把肺组织
取出来做切片，在显微镜下数转移的癌组织的数目。之所以取肺部，是因为肺部和骨髓
是癌细胞转移的主要目的之一。
如果你们不会看癌症组织（就是不会在镜片下分辨什么是癌症什么不是癌症的话），
另外一个方便的办法是把你们用的细胞用某个东西稳定标记一下（比方说可以用GFP,
DsRed等等）然后再打到皮下去。这样一来，转移到肺部的癌细胞就有颜色了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 30 在做一个大片段大质粒连接 insert是 POI-IRES-DSRED
期中 IRES region有一些突变，请问对此有经验的同志么，这要紧么？ IRES位点突变
后容易引起功能缺失么？
非常感谢！ |
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f***4
发帖数: 886 | 31 我们想做两个转基因小鼠，做发育fate mapping
不能用GFP/DsRed来源的蛋白，请问除了LacZ外，还有什么蛋白？
GST之类的能用在转基因吗？ |
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A****9
发帖数: 262 | 34 我的质粒里面也有，但我用了IRES，所以没有影响，表达得很好。 |
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W*******a
发帖数: 1769 | 37 换单体的, mCherry, orange, apple, banana, etc. |
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k****n
发帖数: 158 | 38 没有做wb，准备先在目的基因和RFP 中间加一个linker试试看 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 谢谢回复！！
说到sorting,你有用FACS-Gal sort过lacz expressing line么？
protocol到处都有，但文章上大家还是爱用EGFP/DsRed expressing来 sorting，是有
什么trick在里面么 ？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 嗯。不过有没有更亮的方法。我其实用的dsred或者dtomato |
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s******e
发帖数: 370 | 41 从前用dsRed也碰到过类似问题，当时还兴冲冲的以为co－localization就此做成……
好像现在Tsien实验室已经不建议大家用这个荧光蛋白了，有可能的话换成mCherry？ |
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a*****x
发帖数: 901 | 42 dsRed 是那个647nm激发的dye吗？我用的没有问题啊。。。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 47 The word I cited was from the paper who originally characterized DsRed
expression2, The clontech Manuel seems to have provided very different
information. I rather believe the former.
fluorescent
solubility, |
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i*****i
发帖数: 154 | 48 没有仔细研究过荧光蛋白。
但是绝大部分的荧光蛋白和荧光染料如Alexa 488，594之类的都会有Excitation 和
Emission spectra，这个光谱是连续的概念。如附件一样，都是一个钟形的peak。当然
用峰值波长激发是最有效的，但是附近波长的光也会有一定程度的激发。也有一些荧光
蛋白或者染料的Excitation光谱不是非常的光滑，会形成一个类似的次要峰。 但是目
前我看到的荧光染料而言，还没有看到有两个等高的Excitation波长的。
一般来讲Excitation 和Emission的波长相距不远，488已经是标准的绿色范围了，如果
这样讲就是dsgreen，而不是dsred了。
我觉得看波普是最靠谱的，Invitrogen的molecular probe是很值得一看的。
个人愚见。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 49 我用这个DsRed Express 2做repoter标记lineage，结果杯具了，因为我的绿光filter
是long pass…… |
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s******y
发帖数: 28562 | 50 关键要看用哪个抗体。
如果是用clonetech 的anti-dsRed， 原则上和GFP不应有cross-reaction.
而且不管厂家的数据如何，你自己应该有双重cross-reactivity test,
GFP protein + anti-RFP antibody,
以及 RFP protein + anti-GFP antibody
两个对照组。
在猴年马月之前我测试过一次，在WB结果还挺不错基本没有交叉识别。
但是免疫染色我就不知道了。你最好自己亲自测试一下。 |
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