f*c
发帖数: 2726 | 1 荧光标记DNA，用的digoxigenin-dUTP and biotin-dUTP, 背景好强阿，不知道怎样可
以减弱背景，我用的自己的blocking buffer,不知道用roche nucleic acid blocking
reagent会不会好一点？
我看别人 dig or biotin detection 是在37度，可是我平时做细胞IF都在室温，温度
高一点是不是背景反而会更强？
谢谢 |
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g*****n
发帖数: 250 | 2 没做过Southern blotting吧? 杂交温度42C。如果你不知道为什么？那是你老师的失职
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f*c
发帖数: 2726 | 3 我不是做southern,我做immunofluorescence, 放到显微镜下看的，DNA 上有标记（
biotin)，再用streptavidin-FITC去识别biotin, 相当于western |
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g*****n
发帖数: 250 | 4 看来你的老师真是失职。到现在你还不知道自己在干什么。标记DNA干嘛用？去检测DNA
或RNA。那就是杂交。 |
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f*c
发帖数: 2726 | 5 不是我不知道我在做什么，而是我没说清楚，所以你不知道我在做什么，我们不用
probe, 并不是probe上有标记，而是genomic dna 上有标记，再把 genomic dna 提出
来拉成 dna spread, 然后就是 antibody based detection, 并不是southern
northern, 我都说了类似与 western, 反正没人用42度，37或室温都有人做
Southern杂交 也不一定是42度 |
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m**********3
发帖数: 706 | 6 今天查文献，关键词搜索" survival，retinal neurons". 有一篇文章让我很迷惑。仔
细一看名字和地址，莫非是气功大师的杰作。求鉴定。如果真是，那严大师应该是所有
这些大师，教主里头科研素质最高的了。放在国内都可以PHD毕业了。甚至秒杀大部分
博导.
Int J Neurosci. 2002 Oct;112(10):1209-27.
XY99-5038 promotes long-term survival of cultured retinal neurons.
Yan X, Fong YT, Wolf D, Shen H, Zaharia M, Wang J, Wolf G, Li F, Lee GD, Cao
W.
Source
Institute of Chongqing Traditional Chinese Medicine, Chongqing, Sichuang, P.
R. of China.
Abstract
We have previously reported that XY99-5038, a preparation from a spec... 阅读全帖 |
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d****7
发帖数: 109 | 7 Non-strand specific就不用说了，最简单了，照着protocol来，没啥问题，问题在于
strand specific:
1. strand-specific or not 不影响mapping，因为不管用什么protocol，出来的reads
map到哪条strand都算。再算gene expression的时候才会用到strand information，
具体怎么count reads to gene, 这个要取决于你的strand specific library prep
protocol
2. 拿tophat/bowtie来说，mapping的时候有一个选项--library-type，这个怎么选都
不影响mapping，但是一定要注意，接下来用cuffilink/cuffdiff和htseq-count之类的
，这个--library-type一定要添对了，这个影响gene expression的counting
3. 如何选--library-type？总的来说，如果先测序的reads(R1 reads)是从first-
strand (first st... 阅读全帖 |
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s********8
发帖数: 619 | 8 研究了半天stranded RNA-seq protocol,彻底晕掉了~~
illumina的kit是在second strand cDNA中引入dUTP,然后amplify library的时候这条
链不扩增.
NEBnext的protocol是用USer 酶把这条链degrade,然后再扩增
这俩有什么区别??
我准备用KAPA的kit,因为这个kit不带adapter,需要自己买adaptor,本来想订NEB的
adapter的,但是NEB的protocol又不一样...彻底糊涂了,哪位大侠指教下?不胜感激! |
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