b******k
发帖数: 1874 | 1 I am writing to ask for help.
I am using Miltenyi anti-NKp46-biotin-bead- MS column kit. The first step is
to get splenocyte from spleen by gentlMACS without enzyme treatment. A very
simple protocol, just put spleen into the PEB buffer and let gentleMACS run
m_spleen_01 program once, and filter, spin, aspirate, resuspend the pellet.
The problem comes from the resuspending process. The small tight pellet will
produce(or contain) big clump that is almost impossible to break when 10 ml
PEB buffer i... 阅读全帖 |
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K******S
发帖数: 10109 | 3 what kind of column?
How much EDTA? |
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d********e
发帖数: 81 | 4 platinum EPS C18 analytical column with dimensions of 250mm × 4.6mm and a
particle size of 5 um,
UV-Vis detector at 254 nm.
EDTA is the additive of the blood collection tube and 7.2mg inside the 4ml
tube.
Thank you... |
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b******e
发帖数: 3348 | 5 UV不确定，我们MS的是绝对不允许edta进机器的。如果能免除还是免除吧。
detector |
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K******S
发帖数: 10109 | 6 I think you can try it. EDTA is there just to chelating Ca ions. I don't
think it will affect the hydrophobicity of the drug.
a
4ml |
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K******S
发帖数: 10109 | 7 It is actually quite common to load the sample with presence of EDTA for
phosphopeptide detection on MS. |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stained by GelCode and a bulk of
protein (I assume it was protein) was detected in the pellet part.
你有没有在supernatant中检测到你的target protein？如何检测的？WB or activity?
从你的表述你好像没有做WB。
Then I tried 1L culture and repeated the 2nd experiment. This time, I
incubated the supernatant with glutathione sepharose 4b beads an... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 9 Thank you guys.
I use PGEX2T vector so GST is on the N-terminus.
I normally do 100ml culture size. Here is how I did this:
1. small culture of the bacteria from glycerol stock O/N, about 6-8ml.
2. transfer the small culture to 100ml 2xYTA medium in the next day morning
, shaking at 300rpm, 37degrees.
3. it ususally takes about 1hr 40min - 2 hrs to have an OD600 around 0.75.
4. add IPTG (stock 100mM) 100ul to get a final concentration of 0.1mM.
5. Lower the temp to 22degrees and shake at 300 rmp... 阅读全帖 |
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e*******n
发帖数: 2178 | 10 不可能把。就我这里的情况，正常人想找tech的位置，几乎随时都可以似的。非正常人
就不好说了。我老板以前被一印度博士忽悠了。那个人是印度化学博士，结果发现连
edta都不会配。搞了半天，来问我为啥不溶解。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 化学博士和配EDTA有啥关系，做过才知道。
生物博士养条热带鱼都能养死，美国数学博士不会手开根号 |
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h**********r
发帖数: 671 | 13 同上另外一种方法。
Yeast “smash-and-grab” DNA prep:
• pipette 1-2 ml YPD onto transformation plate; scrape colonies off
with the end of a glass slide and pipette into a microfuge tube
• spin down 15 sec; pipette off sup; if cell pellet is more than 50-75
μl, remove excess and discard
• to cell pellet add 0.2 ml lysis buffer, 0.2 ml phenol/CHCl3 and 0.3
g 0.45-0.5 mm glass beads* (I use calibrated scoop made from cut microfuge
tube pierced with syringe needle) – seal carefully because be... 阅读全帖 |
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m**********2
发帖数: 57 | 14 我用humerus section做in situ hybridization的时候,用 RNA hybridization
incubation 过夜70度,发现tissue结构收缩,如附件所示,图示是我已经完成整个in
situ的结果,事实上我在incubation以后就已经发现tissue结构收缩了.
我问了一些人说需要在fixation的时候做decalcification,我做了decalcification,结
果in situ 的时候tissue还是会收缩,事实上看起来更严重.
我不知道这究竟问题出在什么地方,看起来像是tissue attach不牢固,导致容易变形.请
问有什么方法可以使tissue attach牢固么?
我是根据下面的步骤做的:
1. cut the arms and legs
2. 4% PFA (pH 7.1-7.4) overnight at 4C.
3. PBS three times for 5 minutes
4. 14% EDTA for decal 3 days.
5. wash with PBS
6. store in 70% ETO... 阅读全帖 |
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w*****3
发帖数: 1582 | 15 我做过人的
For preparation of protein extracts, renal tumor tissue was pulverized with
a mortar under liquid nitrogen and suspended on ice in lysis buffer (20 mM
Hepes, pH 7.7, 0.2 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.4 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5
mM DTT, 100 µg/ml leupeptin, 100 µg/ml aprotinin, 10 mM
benzamidine, 2 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 20 mM -
glycerophosphate, and 0.1 mM sodium-orthovanadate).
然后加 sds-dtt buffer里 homogenize sample,煮沸 然后run,
跟细胞不同的是非常容易degradation. |
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n***w
发帖数: 2405 | 16 最近用GST beads，有个疑问，
bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
1mM EDTA (pH 8.0)。
最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
别就是target protein少了，这个我
没有观察到。
我在想到底是哪个地方出了问题。
有经验的同学指点一下～谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 你的质粒的buffer 是否带有EDTA？ 你用的酶是新买的么？
是的，你可以加水
改。 |
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S*********g
发帖数: 24893 | 18 有EDTA
酶不是新买的，但前几天labmate也用过
没问题的
不过我还是check一下 |
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p****p
发帖数: 3360 | 19 Commercial buffers (eg, NEB) can tolerate the 1mM EDTA from TE buffer
because of much higher Mg2+ in the buffers. |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02020104
Substances compatible with the Thermo Scientific Coomassie Plus Protein
Assay. The following is a short list of compatible substances and their
concentrations that the BCA Protein Assay can tolerate. For a more complete
list please refer to the instruction booklet for the product or view our
Table of Compatible Substances for a comparison of substance compatibilities
among several different protein assay methods.
Substance Compatible Conc. ... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 为啥？直接抽不是更加容易？
新鲜的肯定没问题，时间放长了不知道，里面ms没有edta |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 会。
至少有两个可能性：
1。完整的双链环状质粒是很稳定的，但是大质粒在提取的时候容易受损，
可能会在其中一条链上有缺口什么的，放在水中就慢慢会被降解。
2。提取的时候蛋白没有去干净，可能有少量核酸酶残留。特别是如果最后的
溶液里没有加EDTA的话就很容易被降解。 |
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z*y
发帖数: 84 | 23 你说的是bone marrow derived macrophages吗？如果是，可以用0.02%EDTA in PBS来
detach细胞，在4度5-10 min，然后用cell lifter or scraper把细胞刮下来。不知道
你培养这些macrophages的时候用的什么medium，我是用含10% L cell supernatants,
5% horse serum 和10% 胎牛血清的DMEM （0-7天），然后5% L cell supernatants, 5
% horse serum 和10% 胎牛血清的DMEM （7-10天）。或者你可以直接加GM-CSF，但是
我不知道浓度，也没这样做过。如果用普通medium几个小时也许可以，长时间肯定不行
。 |
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c****g
发帖数: 93 | 24 我们用这个lysis buff：
10 mM HEPES/KOH, pH7.6
1.5mM MgCl 2
10 mM KCl
5 mM EDTA
5 mM EGTA
250 mM Sucrose
Adjust pH 7.6 with 10N KOH
然后过过15次#7 needle，低速离心后上清基本是cytosol，无nuclear protein。
10
H3 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
下观察是否会出现truncate.
然后再往后细化条件。 |
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Z**S
发帖数: 1211 | 26 Is the cleavage metal dependent?
If yes, use EDTA to stop cleavage and look for conserved Asp and Glu;
if not, look for conserved His, Cys, Ser, Tyr.
If Zn+ is present, check if there are any conserved cysteines.
fragment
pH8 |
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h**********r
发帖数: 671 | 27 EGTA换成EDTA可以不？实验室没有EGTA
要加lysozyme不？
另外怎么处理？37度30min?
多谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 EGTA和EDTA不一样，好像Mg和Ca的问题 |
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s*****o
发帖数: 26 | 29 只做过一次，好像要注意不能用PBS洗细胞。
Critical Steps
Do not wash cells with a phosphate-containing buffer such as PBS. Load all
lanes of each gel with only simultaneously prepared samples. Because
transfer of phosphorylated proteins from a gel with Mn2+-Phos-tag is
difficult, the gel should be first soaked in EDTA-containing transfer buffer
B and the original semi-dry transfer method4 using three transfer buffers
should be performed.
http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/594#/reagents |
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t****g
发帖数: 120 | 30 正在研究一种被研究得不多的protein, 不少cancer cell line都表达这种蛋白质，但
protein level并不高。 当我overexpress tagged protein之后，发现它能进入
nucleus。 我生物刚入门，不清楚这种能进入nucleus是不是个big deal。 有些疑问：
1） 我用来分cytoplasmic and nuclear proteins的protocol，我的同事质疑我能不能
tell到底这个蛋白质能进nucleus还是membrane. 我用的是在abcam上找到的protocol,
Buffer A (cyto)
10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT,
0.05% NP40 (or 0.05% Igepal or Tergitol) pH 7.9
Buffer B (nucl)
5 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 150mM NaCl
26% glycerol (v/v), pH 7.9
2） 接下来该... 阅读全帖 |
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d****7
发帖数: 109 | 31 问个弱问题
在做ChIP时，IP后我们用下面的buffer来wash IP:
50 mM HEPES-KOH
500 mM LiCl
1 mM EDTA
1.0% NP-40
0.7% Na-Deoxycholate
谁知道这里的LiCl是干嘛用的？我估计是提供一定盐浓度，洗去non-specific binding
。但是为什么不用常用的NaCl，而是用LiCl呢？谁知道有没有什么特殊原因么？
谢谢指教！ |
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M*******C
发帖数: 183 | 32 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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j****t
发帖数: 1663 | 33 Sonicator的功率是否够强？
SDS加得够吗？
可以试一下这个lysis buffer:
Lysis Buffer:
Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
inhibitors
建议follow几个nature protocol 的文章试试！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 34 我们sonicate的buffer里面没有任何detergent，就是plain的Tris EDTA EGTA,
应该是Ren Bing的protocol
0.
detegent
M |
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k*********7
发帖数: 49 | 35 最近小弟我需要从较少细胞量（~1000）中提取genomic DNA，但是由于细胞量不多，始
终找不到很好的裂解提取的方法。
希望看到的高手可以教一下哈。
具体情况是这样的：材料是细胞，不是组织。不想使用kit，想自己配置一些裂解液，
比如tris-HCL，SDS，EDTA等，但是不清楚比例啊，加入裂解液后又该如何处理，比如
温度啊什么的。
求救啊，万分感谢，有知道的同学可以留言，也可以给我发邮件。
Thanks |
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a*******g
发帖数: 33 | 36 小鼠腹腔取得的巨噬细胞，放在tissue culture plate上刺激20h左右后，要用来做流
式。使用3mM EDTA和10mM glucose的buffer在37度放上15分钟后，细胞依然很少脱落。
大家有没什么好办法？谢谢 |
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o**d
发帖数: 3080 | 37 一般来说5mM的EDTA就可以搞定。
还有一种土办法：用注射器（10mL DMEM 无血清）附上25G（或更细）的针头，用力将
mf冲下来，这个要求手劲要大。如果还有很多粘附的，就再来一次，注意要换新的DMEM
。
做flow不需要太多细胞吧，不行的话换Trypsin也可以，反正你也不会再继续培养了。 |
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a*******g
发帖数: 33 | 38 试了ice cold PBS，细胞也是岿然不动。trypsin有说会消化掉细胞表面抗原，大家做
macrophage会用trypsin、EDTA一起来消化脱壁吗？ |
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p****e
发帖数: 105 | 39 试一试3mM EDTA in Cold PBS，用枪使劲吹。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 直接加热过程中dnase的活性不好控制，加了edta应该直接灭了。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 41 这些柱子都是可以regenerate的，你可以看看manual，里面建议是用low pH（5.0），
我觉得也可以用EDTA然后recharge。不过我一般都是一个柱子用在同一个蛋白上。
价格我没有比较所以不是很清楚，不过很方便，看你如何取舍了。如果你需要的量不大
，可以试试1 ml的，纯化个十几mg应该没问题。
GE还有一种柱子是gravity的，也很方便，可以同时操作几个柱子，好像效果也不错，
不过估计也不便宜。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 42
我用的是这个：
Stock Final 10mL 50mL
SDS 8% 0.8g 4g
Tris (pH6.8) 0.5M 0.2M 4mL 20mL
EDTA 0.5M 4mM 80uL 400uL
Glycerol 100% 50% 5mL 25mL
Bromophenol Blue 4% 0.4% 1mL 5mL
glycerol也是50%啊。是不是加点sucrose会更好。
另外，你这个还有Na2HPO4，第一次见到。 |
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H****n
发帖数: 26 | 43 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1.... 阅读全帖 |
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b*******n
发帖数: 605 | 44 目前用的是Jackson lab的quick dirty protocol, 如下：
NaOH extraction (quick "dirty" DNA preparation). Reference: Truett GE et al.
2000. Biotechniques 29(1):52-54
Cut 2mm of tail and place into an Eppendorf tube or 96-well plate
Add 75ul 25mM NaOH / 0.2 mM EDTA
Place in thermocycler at 98ºC for 1 hour, then reduce the
temperature to 15°C until ready to proceed to the next step
Add 75ul of 40 mM Tris HCl (pH 5.5)
Centrifuge at 4000rpm for 3 minutes
Take an aliquot for PCR (use... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 RE:
孵蛋的学第/妹 giantbird05 (大鸟)
Did you use Claycomb-medium ?
if not, please use it
Claycomb-medium (Sigma, Germany)
plus fibronectin/gelatine-precoated cell culture flasks.
more details about stuff protocol
pls go to
PLoS One. 2012; 7(2): e31669.
PuMeb link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285183/
citation:
>Cell culture
>The HL-1 cardiomyocytes (murine atrial tumor cell line) were
maintained in monolayer culture with Claycomb-medium (Sigma,
Germany), supplemented with 10% fetal calf serum... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 注意media Lot的原产国
最重要的一个 可能是
去甲肾上腺素
1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany)
from
北美的有的牛来源的原料
其中的疯牛病因子 and 瘦肉精因子等比德国的EU标准高
以下的所有东西 订货 按原产国来 订货 then try again.
Cell culture
>The HL-1 cardiomyocytes (murine atrial tumor cell line) were
maintained in monolayer culture with Claycomb-medium (Sigma,
Germany), supplemented with 10% fetal calf serum (SAFCBiosciences,
USA), 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamax
(both Invitrogen, Germany) and 1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany) in an incubato... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 G-actin 需要保存在G- buffer( Ca+, EDTA, ATP, Na+, DTT)里（你可以去查
google 看配方，否则很容易变性。
加上适量grycerol 之后可以保存在液氮里。
non－polymerisable mutant actin我做过几个版本，一般都很容易变性，
所以保存在液氮里是对的。 |
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w******u
发帖数: 17 | 48 蛋白solve在8M urea,
最后试过用1M imidazole, 1M imidazole+50mM EDTA,大部分蛋白还是在beads上。
估计蛋白stick在bead matrix上，
大家有什么好的办法解决这个问题？ 谢谢！ |
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f*****e
发帖数: 133 | 49 是Ni-NTA beads?这个不能加EDTA的吧？ |
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