s******s
发帖数: 13035 | 1 buffer都要试的，背景比较强的就上1% Triton-X100, 甚至0.1%SDS，
比较弱的只能0.1% Tween啥的了
buffer |
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j*****a
发帖数: 658 | 2 I am not sure if I understand you well...I thought the difference of non-
ionic (NP40, Triton X100) and ionic (SDS, sodium deoxycholate) is non-ionic
lysis buffer doesn't denature protein. Some of the antibody that recognizes
only non-denature antigen (original state, you might want to say) so that
you can't get good results if you use denature lysis buffer (SDS) with these
antibodies. In anothe word, non-denature lysis buffer is more safe. Am I
wrong?
So I am confused with what you said about "... 阅读全帖 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 3 我没有用过acid wash，我都是按照那个kit的protocol来的，用lysis buffer或者TBS
wash。其实我的银染的条带也目前也没有用western检测到，同实验室的博后检测到过
，但是需要蛋白上样量是我银染的五倍才勉强看到一条带。我们是用Li-Cor Odyssey的
Infrared western，理论上和银染灵敏度相当，但我持怀疑态度。上一个图片，背景比
较大，左边的是对照，右边的是IP，银染，按照kit的protocol的第二次的elution，10
ul上样量。
awesome
my |
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c*********r
发帖数: 1312 | 4 我用的是sea urchin eggs，所有蛋白都是纯天然的。^_^ 不是转染、过表达的。一个
IP用2mg到8mg total protein。起始细胞重量大概是总蛋白的10倍左右。
awesome
my |
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j*****a
发帖数: 658 | 5 which one is your target protein band? biggest band?
TBS
10 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 6 红箭头所示。其实这个条带的大小和预计的以及以前western的结果一致，我还需要再
做一次IP的western来确认。 |
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b*******n
发帖数: 605 | 7 pretty!
However, the heavy band in the middle and at the bottom still look like
heavy chain and light chain. Have you
checked their MW and are they ? If yes, isn't that the kits suppose to get rid of the heavy
and light chain stuff?
TBS
10 |
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s******s
发帖数: 13035 | 8 嗯，我没想过这个denature的问题。
对我来说，non-ionic对lipid作用比较强，对蛋白－蛋白作用弱，所以能去除比较弱
的蛋白相互作用。ionic的分离蛋白作用强点，0.1%SDS还是很稀，不至于蛋白全变性，
能够去掉中等的相互作用，并且溶解一下不好溶的蛋白。
ionic
recognizes
these |
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w********r
发帖数: 1431 | 9 真的猛男只关心那些巨强无比怎么洗也洗不散的强binding，
对需要corsslink才能做出来的当然就不屑了 |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 上次谁说来着，真正的co-ip就是pull down下来，然后用最gentle的条件
稍微洗一次，马上趁热呼上样来着 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 12 You are right. 我觉得中间的也是heavy chain。但是我觉得原因是这样的，抗体放久
了有些聚集，crosslink时大部分交联了，部分还是和其它的抗体结合在一起，然后被
我洗脱下来了。我猜是这个原因是因为重复用过几次的Resin再用的话就没有这个现象
了。
rid of the heavy |
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c*********r
发帖数: 1312 | 13 我想我明白了你说的crosslink和我说的crosslink不是一个东东。。。
我说的是把抗体和beads上的protein A/G交联起来，你可能是指把IP complex里的所有
protein crosslink吧。
不知道我说的对不对。^_^ |
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w********r
发帖数: 1431 | 14 是的，你得到了它：）
LZ问题是CO-IP拖不下东西来要怎么优化。
那么用DSP把细胞内的蛋白连一下，一些比较弱或者transient的binding可以被固定住
，比较容易检测一点，也不用费劲去优化各种buffer的条件——虽然很多人看不上这种
CO-IP.
至于你们讨论的抗体和beads crosslink 可以消除IgG chains，但同时会导致抗体结合的效率更加低。 |
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v*******a
发帖数: 759 | 15 will the endogenous NADH affect the assay?
ab87546.html |
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o*****a
发帖数: 2335 | 16 也许是把那个作用酶饱和了，结果endogenous microRNA发挥不了正常作用，靶基因就
上调了。好像RNAi和microRNA都有这种可能，shRNA不知道。 |
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j*********y
发帖数: 22 | 17 老板说要想文章发的好，必须证明我做的蛋白在实际情况下有不可替代的作用，
overexpression不能
说明问题，会被reviewer挑剔，而且必须要在细胞中knock down或knock out以证明没
有这个蛋白
就致命了。可是我看那些发表的文章，做了这些的寥寥无几，老板说得真有道理吗？还
是他在故意刁难
我？
第一次在这发文，谢谢了。 |
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s****l
发帖数: 395 | 18 关键看研究啥问题吧，很多人用overexpress的system找protein-protein interaction
，也发了cell的 |
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a****d
发帖数: 1919 | 19 Your boss is right. Knocking down assay is more important to address the
physiological function of the target protein. |
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j*********y
发帖数: 22 | 20 谢谢回复.我也明白有knock down的数据会很好，只是从没做过心里没底。不知这个做
多久能有结果呢？ |
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O******e
发帖数: 4845 | 21 To me, over-expression results mean nothing if no KD or KO data. |
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t****1
发帖数: 2 | 22 是的,我有一篇文章已经做了RNAi,还被要求做KO来进一步证明 |
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c**k
发帖数: 1228 | 23 最好再来点结构insight或老鼠 或病人样品啥的
ncs就非你莫属了。 |
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j*********y
发帖数: 22 | 24 这么多要做？现在只做了overexpression和in vitro study，看来我没法毕业了，已经
第5年了，55555 |
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h********n
发帖数: 4079 | 25 那至少做一个siRNA knockdown, 然后siRNA + rescue exp, 很快的 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 27 你想想 你老板故意拿实验为难你的动机是啥？要说他为难你 于是不让你毕业不让你修
课不让你度假还说得过去 |
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j*********y
发帖数: 22 | 28 我就是以为他用这个拖延我毕业的时间啊。之前他说过要我把这个项目作完了再毕业，
我就担心他让我作完KD，又要做KO,然后又要结晶，任何一个都耗时不菲阿。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 29 即便如此也不能说是刁难把 也许你老板对story的质量要求比较高呢。
我的意思是说 如果你把问题放在学术范围内，比如说，到底你们的东西需要多少solid
data才能说明问题 然后卖的不错；而不是考虑成老板提出实验要求是不是要刁难我，
可能更有利于你们通过讨论把问题解决。通过讨论你自己学会怎么才能组织起一个
story也是很重要的技能。光想着他怎么这么多要求，要么消极抵抗要么被动去做都是
没有好处的阿 |
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j*********y
发帖数: 22 | 30 我明白。其实这个故事从一开始就是我自己提出并证明的，老板啥都不懂，每次讨论都
是听我一个人说，我有问题问他都是顾左右而言它，我比谁都希望故事完整，只是不希
望他给我乱指路。本来这些实验室里就没人做过，都靠我一个人摸索，如果他再把不必
要的实验也搬出来，我实在不知能不能做完了。不过看到这里的回复，我不会再消极抵
抗了哈哈。 |
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k*****o
发帖数: 1486 | 32 PhD学生毕业前最低标准是你做的那一小块比你老板强，在那块本来就应该是你给他指
路，你自己摸索，他给你划个圈或者指的大方向就可以了这样的。咱们不羡慕那种从上
手就有nanny手把手教的幸运儿，自己撞撞墙头上灰了反而有助于能力提升。 |
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m*p
发帖数: 226 | 33 Your boss may do not know the details of your research, but he is leading
you in the right direction |
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p*****m
发帖数: 7030 | 34 受教了 能说说悬乎在那里呢？我不是做那个的 就觉得思路很对就是了。按说你在cult
ured cell里也不太可能看得到完全一样的pathology吧，我是想只要有phenotype，哪怕
是很artificial的，但是鉴于cell本身是patient来的，那么针对这个phenotype进行的
genetic/drug screen还是有可能得到endogenous的信息。
iPS做 |
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m**********d
发帖数: 137 | 35 想定量tumor cell里的Reactive oxygen species (ROS)
从invitrogen买的6-carboxy-DCF, 为了确保这个chemical的确能够检测到ROS，首先用
H2O2做了satndard curve：不加DCF,tumor cell有微弱的auto-fluorescence；加DCF的
样品，mean fluorescence intensity（MFI）与H2O2 concentration（0，10，50，100
，500，1000 micro-molar）成线性关系；H2O2 concentration为0的时候，tumor cell
也有较高的endogenous ROS level。整个过程中，对于同一个cell line, FACS的
instrument setting和gating都是一致的。通过这个实验，我觉得比较有把握这个DCF
应该是work了。
然后我给tumor cell不同的treatment和stress，24-72hr,然后用DCF检测细胞内的ROS
水平，之前觉得这些treatment和stress应该up... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 1053 | 37 增加lysate，又增加体积，结果和都不增加一样。
增加lysate，过夜incubate，洗的时候加大盐浓度和detergent浓度，votex几下,要洗
的negative ctrl没了。
不过关键还是抗体，最好是over expressing，用一些常用tag。
如果是endogenous互相pull down，需要很好的抗体才行,抗体不好，就是有相互作用也
做不出来。
如果觉得可能性很大，gst pull down吧,这个比ip靠谱。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 38 换特异性抗体.
有时侯抗TAG,FLAG或者非特异部分的抗体做不出来,换成特异性抗体就可以做出来.
我们还是膜蛋白呢,换了之后就做出来了. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 39 western 信号强化３步流
１）转膜完了用Ｑentix强化一把
２）Ｄevelop的时候用femto substrates
３）用传统胶片取代ＣＣＤ的电子系统
都不行的话，换抗体吧 |
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p******y
发帖数: 47 | 41 哎，我也怀疑是抗体有问题的，但是这个抗体可以用来做IP，能IP外原的蛋白。所以老
板始终不渝的相信这个抗体是没有问题的。 |
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h*******n
发帖数: 2052 | 42 Antibody used in IP does not necessarily work for Western Blot. |
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p******y
发帖数: 47 | 43 有道理额。那我就还是overexpress这个蛋白，看看能不能用这个抗体把exogenous的检
测出来。 |
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r********g
发帖数: 109 | 44 1. Load more sample (100-200 ug).
2. Use fresh sample (AFAP).
3. Positive control.
4. Do not boil your sample or shorten the boiling time (less than 3 min)
5. Increase primary antibody concentration.
6. Change antibody.
7. Give up if you still cannot detect it after trying 3-5 antibodies. |
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p******y
发帖数: 47 | 45 谢谢楼上的。我最后都加到300UG的蛋白了，还是啥都么有~
我试试SHORTEN BOIL TIME 这次~
这个蛋白应该是能测到的，原来的AB就可以，但是原来那个FROZEN AND THAW了很多次
以后就彻底罢工了~哎 |
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r********g
发帖数: 109 | 46 FROZEN AND THAW killed the antibody. |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 一个我做gfp reporter的endogenous promotor太弱了，有什么办法
enhance一下吗？比如类似uas-gal4的系统加一层转录调控放大？
因为要看live cell, 所以不能用gfp-antibody |
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z*******a
发帖数: 175 | 48 I used solid tissue of animals. You are talking about binding of
exogenously transfected protein to
endogenous regulatory elements. I am wondering how you do transfection
efficiency control in the first place
if it is transient transfection. equal exogenously expressed protein makes
your data comparable between
treatments and repeats. I do NOT have confidence to get evenly transfected
efficiency all the time.
greater
only |
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B******o
发帖数: 496 | 49 俺木有经验。都是看paper来的。感觉TALE特异性的确是已经解决了，但是那个
activator domain不是很强劲啊。如果你要activate endogenous gene expression恐
怕会比较吃力 |
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a********k
发帖数: 2273 | 50 花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell. 2008 Sep
5;134(5):828-42. PubMed PMID: 18775315; PubMed Central PMCID: PMC2570342.
Cai L, Makhov AM, Bear JE. F-actin... 阅读全帖 |
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