h**********r
发帖数: 671 | 1 有人用过 Dharmacon FASTDIGEST的内切酶吗？刚在fisher看到了，贼便宜。不知道这
个和fermentas的fastdigest的内切酶兼容不？用过的人说说效果。
fisher技术部门下班了，打电话没法回答。
多谢！ |
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C**S
发帖数: 522 | 2 这两个都是Thermo Scientific的子公司吧，Fastdigest是一个注册商标，不可能给两
种不同的产品一起用。所以这两个公司卖的应该是一样的。 |
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b*******6
发帖数: 39 | 3 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 4 我觉得Fermentas的RE挺好用的，尤其是FastDigest系列的，只用五分钟就可以，还有
就是几乎所有的酶（RE & phoshatase）都用一种Universal Buffer，不用换，非常方
便。不像NEB的有1,2,3,4，每一次用都得查一查用什么buffer，还要考虑BSA，比较麻
烦。但是NEB的RE比较全，也就是这个优点比较明显了。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 5 喜欢Fermentas的酶。RE都换成FastDigest格式的，全部缓冲液通用，和其他修饰酶也
可以通用，做什么都不用换缓冲液，而且连loading dye也给你加好了，非常适合我这
种懒人。T4连接酶，号称室温五分钟（我没试过这么短的）。
克隆载体方面Fermentas有个pJET，便宜又好用，传统的平端T4连接，但是效率很高，
我每次只连15-30分钟，就长出很多克隆。阳性率100%，假阳性率0%，我有时甚至都可
以省下筛选这一步，直接养菌抽质粒了。美中不足的是载体上的常见的酶切位点少了点
。与之相比的QIAGEN的pDrive，也挺好用，但是阳性率不是那么高，。每次还是不得不
挑那么四五个菌落来做PCR鉴定。Invitrogen的TOPO TA载体们，我们实验室和隔壁实验
室用起来都很不顺利，我现在弃之不用。
Invitrogen的Gateway载体们，虽然贵，没办法，只能买他们的，感觉Gateway这么方便
的东西还是只此一家。效率不高，有时会出问题，但是勉强够用了。我曾自己试图构建
类似于pDONR的载体，失败，原因复杂，一言难尽。不喜欢NTI，宁可用最土的BioEdit |
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b*******6
发帖数: 39 | 6 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
Bamh1切（因为Hind3有2个），再用Hind3切，用Bamh1切可以看到质粒线性化，再用
Hind3切可以看到切下来的片段。所以质粒酶切应该没有问题。
4 关于PCR产物酶切。当初经验不足，只在引物两端加了3bp碱基而不是4bp，但是查了
酶切位点表，3bp对各个内切酶都已经足够了... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 7 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
Nice alternative, shall solve the problem in this case...but I would just do
blunt ligation, nowadays, the fast ligation kits from different companies
such as Roche, takara, don't really care about whether it is sticky or blunt
ends, it works just as well...BTW, any one else ... 阅读全帖 |
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x********u
发帖数: 430 | 8 Works very well (Fermentas FastDigestion) and produce high affinity sticky
ends (GGCC). |
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j****x
发帖数: 1704 | 9 分子克隆这块的Kit挺靠谱，很多相比qiagen/roche的更方便省事，质量也很好很稳定
。FastDigest值得推荐，价格也基本和传统酶持平了。
需要上细胞和动物的，那还是qiagen的呗，花钱买个心安。 |
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l******g
发帖数: 1145 | 10 FastDigest是挺好，唯一有点闹心的是和现在用的NEB的buffer不一样，没法一起用。
要是建新实验室的话，真的是很好的选择。
我准备买个midi的kit试试看，要是好用的话，又能省1／3的钱，挺划算的。
多谢～ |
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j****x
发帖数: 1704 | 12 这个有考虑过，但XmaI木有fastdigest版本... |
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