a****c
发帖数: 339 | 1 Read the handbook. Your budget. Whether you have access to HPLC/FPLC.
We made our own gel filtration in the undergraduate lab course... |
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a****c
发帖数: 339 | 2 大牛，问个问题，我自己想不明白。
纯化蛋白或者抗体时，洗脱这一步，这两种哪个好？非FPLC，完全手工的。
１）３００ml washing buffer，单靠重力，慢慢洗；
２）同样体积的buffer, 柱子下面接一段软管，加快流速。
哪种洗的干净？还是和杂质Kon/Koff有关？
100
column |
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m*********s
发帖数: 1188 | 3 感谢帮助...
我打算这么干: (1) 根据大家推荐找到合适的柱子;(2) 用柱子操作分离蛋白.就是自己
灌个小柱子, 让后往下滴...这个FPLC是没有的,指望不了..(3)检测.., 但是我们有个
动态光散射的机器. 我打算把滴下来的溶液按0.2毫升的量收集起来, 然后用动态光散
射当检测器看看分离效果怎么样...
所以关键还是把柱子找准了, 俺才可以开工啊.. |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 如果使用FPLC machine, 因为洗液是用机器灌进去的，不停流动的，所以扩散
效果可以忽略不计，但是如果是手工法在顶部扣一个漏斗那种方式，聚在顶部的洗液内
部的扩散效果不能忽略。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 理论上你可以这么干，不过没有FPLC土法上马的话，做起来很事倍功半。而且我没用过
动态光散射做检测器，不知道它的灵敏度够不够。也就是说如果蛋白浓度低的话，它能
不能测出来。紫外吸收的灵敏度是很高的。或者像前面有人说的，每个fraction都跑胶
看一下，就知道哪个有蛋白了。但是样品管多的话很麻烦。 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 6 the problem is they might not have FPLC system.
by the way, the Gel filtration column itsefl is $1500 or so
. |
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a****k
发帖数: 1130 | 7 强烈建议lz找你们学校有FPLC的lab帮你run一下就好了嘛，一个小时的事情，你这么折
腾个半天可能还分不好，实在不行你寄给我，我帮你run好了，这么个小事情，看得我
都替你急。。。 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 8 这么小的量，已经没法用FPLC 了， 跑下来recovery =0
直接上HPLC ,上一个analytical gel filtration column 吧，
这个很多实验室应该有的， Agilent 1100 series 就可以, 这是公司标准装备
不过那一根柱子还是1千五百刀 |
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y******n
发帖数: 8667 | 9
这些柱子没有FPLC什么的，就不要用。很难洗脱的，很可能容易就流不动。是靠压力让
它流动的。
很多柱子都可以的，柱子上都标有分子量适用范围。 |
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a****k
发帖数: 1130 | 10 6年前没有FPLC用吗？？？
看来我还是没过过苦日子啊，lol |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 是啊，怎么笑得起来啊？
我还记得以前有另外一个版本，好像是蛋白提纯什么的，最后是看到了
Crick 慈祥的向她笑着，然后把她带到了很高很高的地方。第二天大家
发现小女孩倒在了提蛋白的FPLC跟前。当时看完也是让我难受死了，
特别是那个时候我也经常熬夜在冷房里提蛋白什么的。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 12 生物基础研究到底多烧钱？
最近让lab manager做了一年的财务报告，结果还是让我很吃惊。尽管我知道自己属于
学院里给学生发补贴最高的实验
室之一，但人工费只是占据了开销的20%左右（当然，如果按照973、自然科学基金的人
工费支出比例，这还是远远超
额的了），而最大的费用花在了试剂耗材上，占到了50%以上。当然，最初建实验室买
了一批仪器，所以这一年的仪器
费用比例就比较少。
我最近在思考一个问题，就是生物基础研究到底多烧钱？在美国，对生物学科的投入非
常之巨大，他们傻吗？
目前生物基础研究作为重要的学科之一，与社会经济生活也密不可分。我们的经费主要
投入在以下几个方面：仪器、耗
材、测试、房租物业水电、人工费用（因为固定人员的工资是由学校负责，所以这个人
工主要是对学生和技术员而
言）。
这其中，人工费用等于是返还到了纳税人手中。我不知道某些经费资助部门怎么这么想
不明白，非要给人工费设定一个
这么低的阈值（不超过10%）。也许由于我自己经历的原因，我赞同给博士生博士后高
工资。大家都不是不食人间烟
火，博士生待遇在国内外的巨大差别也是我们对于缺乏吸引优秀学生竞争力的原因之一
... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 13 生物不算烧钱，不过烧掉了很多人才，
这些孩子一样聪明，本来能给国家民族做点贡献的。
生物基础研究到底多烧钱？
最近让lab manager做了一年的财务报告，结果还是让我很吃惊。尽管我知道自己属于
学院里给学生发补贴最高的实验
室之一，但人工费只是占据了开销的20%左右（当然，如果按照973、自然科学基金的人
工费支出比例，这还是远远超
额的了），而最大的费用花在了试剂耗材上，占到了50%以上。当然，最初建实验室买
了一批仪器，所以这一年的仪器
费用比例就比较少。
我最近在思考一个问题，就是生物基础研究到底多烧钱？在美国，对生物学科的投入非
常之巨大，他们傻吗？
目前生物基础研究作为重要的学科之一，与社会经济生活也密不可分。我们的经费主要
投入在以下几个方面：仪器、耗
材、测试、房租物业水电、人工费用（因为固定人员的工资是由学校负责，所以这个人
工主要是对学生和技术员而
言）。
这其中，人工费用等于是返还到了纳税人手中。我不知道某些经费资助部门怎么这么想
不明白，非要给人工费设定一个
这么低的阈值（不超过10%）。也许由于我自己经历的原因，我赞同给博士生博士后高
工资。大家都不是不食... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 可不可以具体跟我说说？
只是做过一些SEC
但是对FPLC的东西不是特别熟 |
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o****e
发帖数: 1011 | 15
SEC/FPLC基本原理一样啊："大"分子进入不了column填充粒子内部的细孔道，只能通过
各个填充粒子之间的空隙走，所以很快流出柱子，retention time短；"小"分子可以钻
进各个"填充粒子"内部的孔道，所以不容易从柱子里流出来，retention time长。
同样分子量的两种macromolecules A和B，如果A结构"非常紧凑"(compact)，而B结构"非
常舒展"(蓬松？)，那可能出现的情况就是A容易钻进填充粒子内部而B不能，于是造成A
的retention time相对长些。这时的情况就是，同样分子量的两种分子，各自的
retention time并不相同。（Light Scattering这方面比较有优势，可以测
hydrodynamic radius以及molar mass）
另一方面，A/B除了分子量，还可以有比如亲水/疏水等性质上的差别。"A/B分子本身对
column填充材料的吸附"也影响它们的retention time。A若格外容易"粘"在填充粒子上
的话，那A的retention time也因此要格外地长一些。一般eluent都是buf... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 我的意思就是说虽然做过一些FPLC的东西
但是对整个liquid chromatography的东西都不是很熟
知道原理
跑过SEC，resource Q, resource S
不过都是几次而已，没多少经验
所以才需要求教嘛 |
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f**e
发帖数: 2160 | 17 10x buffer 和1x buffer, 你把一个往另一里面滴，看折射界面就分出来了
10x的重不少
再有，用枪取1ml弄到天平上称重也能分出来，或者如果有fplc的话，打一点进
conductivity chamber，一看电导率就知道了 |
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y*****1
发帖数: 73 | 18 降解是蛋白本身性质决定, 具体可以在expasy的protparam上查estimated参数
另外你说看不到13kda的带不排除电泳已经跑没了 可以上FPLC用uv检测 |
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m********r
发帖数: 124 | 19 我们是做生化的，体外纯化蛋白，做相互作用（fluorescence，ITC，pulldown），
顺便做点结晶和核磁，mapping作用位点。我第三年下了。
Rotation 的时候做一个真核信号通路蛋白的A domain（这也是老板postdoc做的
domain），是个很好纯化的蛋白，做的还行，有个coauthor的paper（师兄一作，4分左
右，话说我觉得实验室就这个水平了）。
加入实验室之前，另外一个rotation的学生做B和C蛋白，是原核的信号通路。当时
我感觉我加入实验室是不就做这个了。结果老板让我先做D和E， 顺便做原来的真核蛋
白的F domain，理由是应用的技术是一样的，要charaterize的蛋白性质也是相同的。
这是实情。这个时候有个小的grant, 关于蛋白BCDE的。结果我第二年冬天发现F
domain太大，不好做。而D和E表达起来比较困难，不可溶。加上B和C合作者有genetics
的data，所以就做了点这个。之后回国，春天回来做助教，上课考qualify，几乎春季
没做实验。完了之后，发现D和E 已经被马普的两个组发了。人家一... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 因为手上的蛋白有high pI (>10)
准备用离子交换柱作为第一步粗提
就是直接lysate 9kg离心后上柱子
看了看GE的网站
CM sepharose fast flow resin,weak cation
SP sepharose fast flow resin,strong cation
好像都可以用
不过看起来都是要和FPLC一起用的
想问问看有没有人知道如果用普通gravity column行不行?
pack的时候有没有要注意的?
哦,还有个问题是我应该选CM还是SP? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 谢谢!用的就是这个guide
选出来三个
Capto S
SP
CM
然后Capto S比后两个贵一倍
不想用FPLC是本来就是粗提
条件摸好了以后gravity column也比较快
然后后面再上亲和层析(有tag)
还有一个是我们没有空柱子
然后这个县Cation exchange再Affinity的想法我没有试过
不知道好不好使
所以不想一下子再买好多东西
就想gravity column先试试
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/86545
257628001CC7BA/$file/18112731AH.pdf |
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L********g
发帖数: 4204 | 22 do you have antibody against B C D ( I suppose you have or at least B C D
have tags), your GST results have somehow support your hypothesis, so you
can add some more evidence
1)co-IP, give in vivo evidence (need tagged A expressed in cells)
2) gel-filtration(size exlusive column) using FPLC, check their
cofractionation status, if they all comes out at the same fractions (peaks
overlap). This may require equipment and buy columns. |
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D******9
发帖数: 2665 | 23 you have to separate the protein complex(es) by FPLC, then check the
component of different fractions. |
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x*****o
发帖数: 441 | 24 一直对于从包涵体里面提纯蛋白感兴趣. 是不是这样做不好? 我们组里面提纯的蛋白就
算是可溶性的也用non native的方法纯化,就是6M Urea denature,然后ion exchange
FPLC, 然后再dialysis. 所以最后都用包涵体了.
是不是用ion exchange 必须denature阿? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 “亲和层析之前用个4-5M NaCl洗洗干净”
——请教一下，这是什么意思？
是说用4-5M NaCl把亲和层析柱洗洗么？
另外，以前做这个蛋白的时候一般我们都不用UV来读浓度的
做亲和层析也用的gravity column
不是用的FPLC，有UV monitor
浓度都是做bradford或者BCA来测
所以没有观察到不寻常的UV
我不觉得这个应该归结为“没仔仔细细把这个蛋白的性质好好记录过” |
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x**k
发帖数: 358 | 26 Scientist or Senior Research Associate
StemRD is seeking a scientist experienced in protein purification with a
focus on secreted proteins.
Demonstrated proficiency in the design, execution, optimization and
troubleshooting of protein purification
processes is required. Proven experience in characterization of proteins is
essential. Ability to analyze,
interpret and effectively present data at group meetings or to customers is
required. Experience in cell
biology is highly desirable.
In retu... 阅读全帖 |
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L********g
发帖数: 4204 | 27 I am planning to do some protein purifications recently.
Is there any myc affinity column purchasable? I checked GE, there is no such
commercial column. Or people usually make their own myc column?
My lab has a FPLC system so that I really wish I can buy some column that I
can hook to the system (not a syringe of myc-matrix) .
I will giv Baozi to ppl who can help. Thanks. |
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x**k
发帖数: 358 | 28 【 以下文字转载自 SanFrancisco 讨论区 】
发信人: xork (xork), 信区: SanFrancisco
标 题: 湾区蛋白纯化的工作机会
关键字: 蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 7 12:07:24 2011, 美东)
Scientist or Senior Research Associate
StemRD is seeking a scientist experienced in protein purification with a
focus on secreted proteins.
Requirements:
PhD, BS, MS or equivalent in biochemistry or a related discipline;
5+ yrs of relevant protein biochemistry experience;
Experience with FPLC and HPLC;
Hands on experience with cell culture techniques is highly p... 阅读全帖 |
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t**m
发帖数: 158 | 29 http://t.cn/zO6Vxfd
师父领进门，修行在个人 -- 和研究生们分享一些实验室小经验
前两天和学生讨论课题，一个不做这个课题的学生也跑过来听，虽然不说话，但明显用
心。讨论完课题，我对这个学生大加赞扬 -- 他让我想起了读研究生时候的自己（咦？
好像在自我表扬呀）。
想想我做研究生时候的一些经验和教训，似乎有两条比较可取，记下来与大家分享一下。
1. 用心观察实验室senior成员的操作，不放过每一个参加实验室内部讨论的机会
2. 记住自己和别人的每一个实验失误，同样的错误绝不重犯
1. 用心观察实验室senior成员的实验，不放过每一个参加实验室内部讨论的机会
记得上大学本科的时候，有一位教授在课上给我们讲本系毕业的牛人，提到了钟毅（好
像是），说他读研究生的时候，每次导师一到实验室谈课题，他就凑过去听，久而久
之，他的见识就比同时进实验室的人强。后来他博士毕业，也没做博后，就在冷泉港拿
到了教职。可能是出于对牛人的敬仰，我记住了这句话。当我自己进了实验室，潜意识
里总想着这句话，不过稍微扩展了一下，不仅是导师谈课题，我凑着听，其他的senior
成员谈课题或实验技术... 阅读全帖 |
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r******t
发帖数: 629 | 30
请问怎么optimize条件啊？
汗，啥叫梯度拉不开？
另外就是一般重力过柱子，还是灌柱后用fplc？ |
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i***0
发帖数: 160 | 31 If you dilute the high concentration protease to low concentration its
activity increase, then the decreased activity at high concentration is
reversible, which is good. It might due to the storage buffer you use for
concentration not friendly for the activity of the enzyme, or reversible
oligomerization that enclose the active site.
If you dilute the high concentration protease and can not restore the
activity you have seen while it is at low concentration, it is possible,
that it is aggregated... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 Using FPLC, HPLC, or Mass Spec 来分离大分子和小分子。
又快又简单，就是对器材要求高一些。 |
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e****e
发帖数: 1042 | 33 Thanks for your suggestion! But we currently already use HPLC to quantify
our peptide product. Protein cannot be quantified by FPLC\HPLC, right? I'm
not sure about Mass spec though. |
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b******y
发帖数: 627 | 34 For LZ,
sunnyday's desalting method is the best to try. I will be surprised if it
doesn't work. I guess you have to use a syringe because nobody likes to
inject 32P into their FPLC. In that case, you should be careful of the
fraction size. Don't mix two well separated peaks during fractionation.
kaka1000's vivapure spin column离子交换柱 is a cation/anion exchange column,
to which unlimited volume can be loaded. In the end, elute with B buffer.
The peak is sharp because the salt concentration is high ... 阅读全帖 |
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f******s
发帖数: 440 | 35 搜搜Celline bioreactor, 高浓度细胞培养
给lab scale用的
如果不够的话，养10L不常养就用shaker flask或者spinner bottle. 买个wavebag
system 就用一次是吃饱了撑的
到了10L要考虑过滤细胞，titer多高，跑多大柱子还是batch, 有没有FPLC...如果能提
高titer会事半功倍，试试不同cell line, 培养液...
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.3 |
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s******9
发帖数: 283 | 37 透析或过desalting column，蛋白提纯的常规操作。 |
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c******o
发帖数: 63 | 39 好怪的问题，你怎么知道imidazole还有残存？ |
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r******m
发帖数: 173 | 41 dialysis (exhaustive dialysis with large volume of buffer)
SEC (works the best most of the time,although your protein got diluted
afterwards.)
column |
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w*****g
发帖数: 95 | 42 We just switch from Akta to Duo Flow.Duo Flow is half the price of Akta. If
you have the chance to learn changing the pump, fixing is not a big deal. |
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d******1
发帖数: 709 | 43 handy man should use Duo Flow |
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f****l
发帖数: 5514 | 44 都用过,感觉大同小异. AKTA放在冷室里因为湿气的缘故,3-5年里基本必定出各种问题. |
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b******y
发帖数: 627 | 45 Duo Flow has its own temperature control? |
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m**p
发帖数: 2471 | 47 duoflow便宜，保养简单，操作繁琐些。其他没啥区别 |
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b******e
发帖数: 88 | 48 你要是有大的prep grade的柱子比如26/60可以试试不浓缩直接过柱子
我觉得很有可能是你的蛋白浓缩以后已经不happy了，甚至开始precipitate然后被FPLC
里面的filter给滤了，你最后那个峰八成是imidazole，这也解释了为什么你的蛋白不
happy，因为concentrator浓缩事实上也会提高imidazole浓度
我的经验是一根affinity后直接用concentrator浓缩的方法很多情况下对蛋白不是太好
，但是可以用别的方法曲线救国，比方说可以过一根IEC，这样会除去imidazole，出来
的峰也会非常高，不需要浓缩就可以直接上SEC，SEC过后出来的蛋白很多就可以正常浓
缩了 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 49 不是的，这些东西，难度不大。
难在营销，建立很庞大的市场知名度和销售渠道。否则真不够养活开始那些人的。
mouse gene KO 是个手艺活，单个项目收费可以很高。
高质量的生长因子，1mg 4300 usd，真要掌握技术程序，摇个2000ml LB E.coli. ，
lysis，refolding if necessary， FPLC and/or HPLC，简简单单就出来了。但光靠这
个是无法生存的，
哪里有顾客？ 人家凭什么买你的？ 人家愿意多少钱买？ 有谁1mg 的买？ |
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