s*****g
发帖数: 7857 | 1 先做个MTT筛一下细胞对G418的敏感性。看多高浓度G418能杀死大部风细胞。
然后转染。
把转染的细胞稀释放入培养皿中，等他们附着后（24和）加G418，这时候大部分细胞
浮起来了，换培养液（含G418），总有单个细胞能附着生长。由单个细胞长成克隆。然
后用小圆柱体收集单细胞克隆。
选8-10个克隆细胞分别放入8-10小培养皿中，继续加入抗生素，阔增细胞数量。。。。 |
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h*****G
发帖数: 113 | 2 human embryonic stem cell， 用puromycin和G418 select double positive 的细胞。
一般大家是puromycin和G418一起加，还是先加puromycin，过几天后再加G418? 谢谢。 |
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g*****n
发帖数: 250 | 3 还在讨论？
细胞既然已经筛选好了，还加G418干吗？筛选时没杀死的细胞，这会儿加的G418就能杀
死了？特别是加低浓度G418。解心疑吗？ |
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w*****r
发帖数: 2061 | 4 是不是G418只能筛选HEK 293？HEK 293T自带G418抗性？
多谢 |
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s******r
发帖数: 2876 | 5 293T本身应该是G418 resistant，不然它那个大T抗原怎么进去的。
HEK 293T 本身不带G418 抗性。
但是因为 293T可以不停的复制环状的质粒，所以不管是否稳定转染，都会有抗性，
会导致你很难筛选出被稳定转染的细胞。 |
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b****h
发帖数: 18 | 6 本来不怀疑这一点，但有同事说G418适用于杀死能增值的细胞。我最近打算赋予特定类
型的 neuron具有neo或puro的抗性，然后杀死其他类型的neurons和杂细胞。有哪位做
神经的兄弟用过G418或PUROMECIN筛选/杀死neuron的经验吗？我指的是元代老鼠或人的
neuron。多谢！！！ |
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l****j
发帖数: 70 | 7 用的1mg/ml G418筛选的稳定转染细胞，在后续的传代培养过程中，还要持续加低浓度
的G418吗？比如100ug/ml,10ug/ml, or 1ug/ml? |
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m*****y
发帖数: 420 | 8 我就一直都没用G418筛选出来过，筛的过程中细胞形态就变了，原来的细胞可以紧紧贴
在plate上，后来细胞变了而且很容易detach.... G418筛选该怎么弄啊，实验室没人用
这个，没人请教。 |
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z*t
发帖数: 863 | 9 各位大侠们以前有谁做过leukemia cell line的G418筛选没？ 我尝试电转都不是特别
成功。。。
因为leukemia cell line是悬浮培养，加G418后很难区分死活。。。
胞 |
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c*******r
发帖数: 440 | 10 1. 是不是转染的外源基因片段越小越容易整合？ 多大的片段不容易整合（既极限有多
大）
2. 如何筛选悬浮细胞的稳定表达系？ （用G418） 要挑琼脂糖板吗？ 本人只做过贴壁
细胞的筛选，方法有什么不同？
请做过该实验的多多指导，多谢！ |
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J*******6
发帖数: 72 | 11 有国内的药厂要我在美国为他们卖G418, aka Geneticin, 纯度达》98%。it is used
to select transfected stable clone in cells.
一般哪里会要？如有需求， 能回扣。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 12 IP is seriously protected here. You will get into trouble,unless the company
owns the patent of G418 or purchased the permission from other patent owner
. |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 HEK 293T 本身不带G418 抗性。
但是因为 293T可以不停的复制环状的质粒，所以不管是否稳定转染，都会有抗性，
会导致你很难筛选出被稳定转染的细胞。 |
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b****h
发帖数: 18 | 14 the idea is to knock in Neo in hESC, driven by neuron-specific promoter,
then differentiated into neuron. Only specific neuron can survive under G418
pressure. I also think it will be slow, puromycin is faster? I am not sure
for neuron, as they cannot proliferate.Any experience will be highly
appreciated. Facs cannot be used for attached neurons. |
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M*****n
发帖数: 16729 | 15 using Neo(r) is not a good idea to do this negative selection.
read more papers and you will find better selection markers.
G418
sure |
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k****n
发帖数: 158 | 16 请问，用g418筛选稳定转染的3t3一般用多大的浓度，需要多长的时间， 我试了一次用
到500ug/ml，经过了14天，效果不是很好，请问这个细胞有什么要注意的嘛，感觉比
cos7要难筛选很多。
谢谢！ |
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b******9
发帖数: 102 | 17 我们是终浓度600ug/ml，转染48h后加G418，压2周。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 大家一般都筛多久呢？
筛出来有多少是干净的homozygote?
我用6mg G418 筛了25天就6，7个克隆…… |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 一般双抗就一起加呗。G418很慢，大概要三五天才有反应，不喜欢用，Puro很快。
胞。 |
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t*****2
发帖数: 213 | 20 keep culturing in medium with half of the screening dosage of G418. |
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f*c
发帖数: 2726 | 21 According to some protocols, the concentration of G418 could be reduced for
maintaining. But I used the same concentration for both screening and
maintaining. It seems okay. Are there any problems? |
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l****j
发帖数: 70 | 22 看来大家一致认为都应该继续加G418，
只是maintaining的浓度不一样，可能具体多少浓度没太大影响，重要的是一直要加。 |
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J*******6
发帖数: 72 | 23 有国内的药厂问我在美国为他们卖G418, aka Geneticin, 纯度达》98%。it is used
to select transfected stable clone in cells.
一般哪里会要？如有需求， 能回扣。 |
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G****a
发帖数: 10208 | 24 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: toptip (土翁), 信区: Biology
标 题: 从骨科医生到诺贝尔奖-山中伸弥的研究历程
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Oct 17 00:04:30 2012, 美东)
引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳... 阅读全帖 |
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t****p
发帖数: 1504 | 25 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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t****p
发帖数: 1504 | 26 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 27 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: toptip (土翁), 信区: Biology
标 题: 从整型医生到诺贝尔奖-山中伸弥的研究历程
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Oct 17 00:04:30 2012, 美东)
引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 28 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
问题1，
最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。... 阅读全帖 |
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a******7
发帖数: 7936 | 29 做过牛intramuscular adipocytes的immortalization，转染带抗G418的端粒酶，怕转
染效果不好连续转染两次，存活的细胞都抗G418，并且一段时间不加G418也不会改变抗
性。 |
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b******r
发帖数: 111 | 30 I am doing a knockin project. I have done constructs which contain Neo and
HSV-TK for selection in ES cells.
How do I know Neo and HSV-TK in my plasmid work? Specificly,
Do Neo and HSV-TK genes in my plasmids express their proteins in E.Coli? I
tested in this way: grow 4 tubes
of E.Coli, when adding G418, E.Coli can't grow; When adding gancyclovir, E.
Cori grow well. That means Neo
and HSV-TK genes of my plasmids don't express in E.Coli, right? Then why
do Neo and HSV-TK express in
ES cells? ... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 31 1. 方案2显然更合理，因为你没有设置标定转染效率的内参（如果我没有理解错的话）
，那么先6-well再seed到24well plate实际上是一种标准的近似normalization的处理。
2. Lipo转染过程中毒性物质的效应会被放大，也就是为什么连抗生素都不推荐加。既
然已经stable transfected，自然一般就没那么容易丢，别说就是转染这几个小时，一
个星期不加问题也不大。我手头的一个细胞系，平时传代的时候加G418，真正到了做实
验的时候，都是提前把G418撤掉，免得对assay有不良影响。 |
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c**n
发帖数: 73 | 32 我是用serial dilution做的稳定细胞转染
得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
后。 |
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s*********r
发帖数: 22 | 33 我最近刚做的stable cell line , 用的是pCDNA3.1 载体
用的是zeocin筛选，不用G418.开始时候我自己用G418筛选， 老板告诉我是错的，要用
Zeocin筛选。
我尝试过转染293和293HK。
转染是regular钙转。 细胞密度是60%。转染后6小时就加药（也尝试过12小时）
zeoxin浓度是400ng/ml
基本上等conflent后，大概3-4天，1：2到2个100mm dish，5天后很多细胞死了，此时
转移到60mm dish，等single coloney . 然后等2周 ，看到很多coloney长出来， 然后
pick up到48-wells .
1 |
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n********k
发帖数: 2818 | 34 well,it is a problem-solving issue: there are always many choices and I
would think it over and over like with any complex experimentations: what
are the options and what might be a best one to approach this...As far as I
am thinking, the less passaging the better...otherwise one might be running
a risk of picking the cells from a same clone multiple times; as well, the
clonal growth/death bias over the passaging could also dramatically change
the properties of the culture over time...numerous ... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 35 有哪位同仁用过Hepa1c1c7做稳转，G418筛选的浓度大概是多少～
我自己做了kill curve，大概是500ug/ml，但是我当时split细胞后马上就加的G418，
据说这样不好～
查了文献，有的人用500，也有用800，问了周围的人，说600的也有～
有用过的同学能给说说吗？【我的培养基就是DMEM+FBS+1%PSG】
谢谢啦～ |
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C******2
发帖数: 97 | 36
vectors
The construction is modified and derived from pRetrosuper which is used for
random mutation in host genome based on gene-trap. Truncated 3’LTR
fragment is promoter activaty lost. The idea is host genome will be mutated
by insertion because the existence of splicing acceptor(SA) fragment thus
generate a fusion RNA containing cherry CDS. Fusion florescence protein can
be detected in some case when insertion occurs as an in frame manner. The
insertion will also make the infected cells be... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 37 我能想出来的就是IRES接G418一类的。这就搞掉/改变了3-UTR一类的。不知道一个G418
的expression casseette能不能插到intron里。
Biotech的文章用的是GFP fusion.我用的是mutant的特性来select。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 38 转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
有问题。
看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
的tip，在显微镜下挑。
挑的过程如下：
100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指
一松，就把那团细胞吸进了tip。这20 ul的细胞带PBS放进96-well的平板里，加20 ul
trypsin, RT处理5-10分钟，加100 ul medium就可以转移到别的平板里了。看colony大
小，很多时候我就直接进24-we... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 39 对BP系统不熟悉。你上次说可以不留下任何痕迹，那肯定比Cre/LoxP好。LoxP我记得蛮
长的，就是在initron里，也担心影响splicing。
个人觉得没必要两个颜色的selection maker。这样导致在两个homologous arms之间的
insertion太大。看了他用PCR来确认正确克隆，实际上是两个HDR arm上一边一个PCR来
确认的。不知道是不是担心PCR有不确定性，还用了southern来证明integration site
。这个太麻烦。从他用一个颜色的selection marker（Fig2)来看，拿到double-
replacement的效率不错，40%。说明一个颜色就可以了。或者，我就干脆用一个G418。
我记得一个G418的表达cassette只有1。2Kb,在这个cassette两边加PB,PB外面是HDR的
arms,一边1kb。这样，要确认正确克隆的时候，用一对在HDR template外面的PCR
primers,就可以解决了。这个PCR产物是1+1。2+1=3。2kb，NEB的Q5 polymerase应该可
以了。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 40 不就是用G418强迫质粒插到基因组里嘛。你肯定不是钱老。 |
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R*s
发帖数: 2041 | 41 for stable transfection: u include a selective marker (such as G418,
puromycin) in the DNA construct will transfect cells with. Then by
including the antibiotics (G18, puro...) in the media, you will be
able to seletively grow up the cells trasfected with your construct, while
killing the untrasfected ones.
For transient transfection: you don't have such selective markers in
the constracuts. You will always grow cells in regular media. Since it
is impossible to achieve 100% transfection, there i |
|
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J********3
发帖数: 3151 | 43 我用的pCAG2LMKOSimO，MEF确实转染效率很低，但选的是stable lines，也无所谓了，
大不了多用点细胞，俺用0.6mg/ml的G418筛十几天，挑的客轮，效果还可以。MEF是俺
自己做的，immortalized MEF比primary MEF要容易些（俺用p3开始转染成功，p2应该
没问题），但个人感觉immortalized MEF诱导的iPS没多大用，因为在漫长的
immortalize过程中发生了n多的事情，细胞基因组本身已不大稳定，iPS估计很容易癌
变。
( |
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j********r
发帖数: 156 | 44 多谢帮助！巧的是我最初从addgene买的两个质粒其中一个就是pCAG2LMKOSimO。在293T
中满眼的红色，在primary MEF中啥荧光都没有。请问你G418拿到的克隆显微镜下有荧
光吗？原来primary MEF也能长十几天，我也来试试。Thanks a lot, |
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p****n
发帖数: 9263 | 45 没人会要吧，文章投出去， M&M里边写药品是黑市上买的... |
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s******s
发帖数: 13035 | 46 这种大众东西不用提的吧。倒是人家几千上万美刀试剂和工资作出
的东西，谁会为了省几十快用你的呀 |
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x******8
发帖数: 350 | 47 一般做真菌转化的实验室会要的，但是量都不是很大的说。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 48 在国内卖还差不多……
在美国谁会省这种小钱冒大风险啊 |
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k****n
发帖数: 158 | 49 用g418筛选一个稳转的细胞系，抗性克隆里面gfp 荧光信号很弱，肉眼不可见，只有用
荧光显微镜照相才能看到，但是也很弱，问，这种现象普遍吗，用FACS筛选GFP细胞可
行否？
谢谢 |
|
H*****e
发帖数: 120 | 50 Also asking:
Can 293T cells stably infected by one retro- or lenti-virus produce virus if
transfected with the packing system again? |
|
