m*********D 发帖数: 1727 | 2 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好,唯一提醒的是primer(match的部分
)长一点,我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下,annealing的温度适当比用普通Taq
低点,3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate,一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点,重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶,加到pcr
primer的5’end。一般情况下,我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以,你的primer该是:4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点,我几乎每次都
能用上。其他的看运气,识别8 ... 阅读全帖 |
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