a*****l
发帖数: 244 | 1 想用CRISPR在iPSC里搞point mutation，看了一下最简单粗暴的方法是合成Donor DNA
（100bp-200bp），合成gRNA ，然后买现成的Cas9蛋白直接搞。
听说 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成DNA 不错，但不知道哪里去合成gRNA
和买Cas9蛋白比较靠谱。具体来说，请教大家以下几个问题，希望大家多多指教！
1）gRNA去哪里合成？听说合成的RNA错误率比较高，还是让公司做 in vitro
transcription 更靠谱？
2） Donor DNA用双链还是单链比较好？
3） Cas9 蛋白在哪里买好？
最好是美国公司。谢谢大家！ |
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C****n
发帖数: 79 | 2 由于要在不同的物种里试，Addgene的载体对我来说，就是Cas9的序列和gRNA的
tracrRNA部分可以用。我是直接用PCR的，设计了一个很长的引物，直接把20bp的gRNA
加在upstream primer上。 |
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g*****x
发帖数: 3283 | 3 小弟不是做生物的，有个关于CRISPR的问题想问下各位。如果gRNA的5'被磷酸化，对识
别和反应活性会有多大影响？目前看文献5'的tolerance非常好，但找不到用5'-
phosphate的gRNA的具体实验，大家有没有什么意见？先谢过了～ |
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K********g
发帖数: 58 | 5 so ask for the anneal and phusion extension protocol, thanks
gRNA |
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l***y
发帖数: 638 | 6 church的这个质粒克隆很麻烦，还不如直接gBlock合成
其实你可以去搞一个zhang feng的质粒把gRNA casette弄出来随便找个质粒一插，然后
用他的protocol克隆 |
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k****l
发帖数: 279 | 7 gRNA synthesis costs over $1,000 and you don't get much
I ordered gBlock DNA template, did in vitro transcription and purification
myself
It's pretty easy |
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w********a
发帖数: 324 | 8 关于CRISPR gRNA 的设计，针对细菌的，有好的program可以用来避免脱靶效应吗？
真核的已经有很多程序和软件了，不知道针对细菌的有没有？难道就是自己简单的
BLAST吗？
谢谢！ |
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d****u
发帖数: 1553 | 9 这个为什么载体分开滴度会低我们也不清楚。我们只是把几个主要实验室的载体要过来
在我们的系统里测试得到这样的结果。就像我上面说的，因为我们是用原代细胞，所以
可能没什么代表性。我们能下的结论就是Zhang lab的文库可以提供令人满意的滴度。
而随后的测序也证明的他们的文库里不同gRNA的distribution（也就是说平均每个gRNA
在文库里的丰度）也比较令人满意。你说的这个实验室的文库我们没有试过，我的建议
是最好对比两到三个不同的系统，然后决定用哪一个。
关于信噪比，在这里主要是指假阳性和真阳性的比例。因为在目前绝大多数的基因组级
别的筛选中，假阳性是一个没法回避的结果。虽然有很多方法可以减弱假阳性出现的概
率，但是基本没有可能完全消灭。那么在实验最开始的阶段，文库本身质量的优劣就从
一定程度上决定了你最后筛选结果的信噪比。举个例子说，如果你有两个文库中，第一
个文库中每一个gRNA都是均匀分布的，如果有80000个gRNA，每一个都有10000个copy在
你的文库里（现实中不可能实现），而第二个文库也有80000个gRNA，但是有10%到20%
的gRNA只有少于100个c... 阅读全帖 |
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c*****1
发帖数: 22 | 10 gRNA和Cas9就相当于一个小小的足球在足球场（细胞里），为啥gRNA能够那么有效率的
和目的target结合呢？是不是只要gRNA靠近就有一种吸引力把gRNA吸过去呢？
展开来，为啥细胞内的蛋白结合这么特异。是不是在细胞（已经很小了）里，相互作用
本来就很容易？ |
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发帖数: 1 | 11 CRISPR, /ˈkrɪspər/, is a family of DNA sequences in bacteria
that contains snippets of DNA from viruses that have attacked the bacterium.
These snippets are used by the bacterium to detect and destroy DNA from
further attacks by similar viruses. These sequences play a key role in a
bacterial defence system,[2] and form the basis of a genome editing
technology known as CRISPR/Cas9 that allows permanent modification of genes
within organisms.[3]
The CRISPR/Cas system is a prokaryoti... 阅读全帖 |
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y****m
发帖数: 37 | 12 in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
common false positives in any genome-wide screens. |
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O**********a
发帖数: 317 | 13 不表达的就不会work，也不会被筛选富集啊
[在 yyadam (sunwind) 的大作中提到：]
：in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
which are
：common false positives in any genome-wide screens.
：........... |
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O**********a
发帖数: 317 | 14 我现在有Cas9的老鼠，想敲掉一个基因，用HDR模版引入点突变。准备直接注射卵；因
为有Cas9老鼠，所以只需要注射gRNA＋HDR template。
设计好了gRNA，是必须构建载体用T7加酶体外转录获得吗？
为了简便，我考虑直接合成gRNA＋scaffold RNA。加起来有104 mer，是不是不可行？
这个长度的RNA能直接合成吗？是不是会很贵？
非常感谢！ |
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h*****G
发帖数: 113 | 15 只要是mamalian codon optimized的Cas9就可以，最好带GFP or antibiotic
selection，这样可以sort transfected的细胞。
Cas9-2A-GFP/Puro-U6/H1-gRNA的最好。
对于knock-in cassette, 如果你只是single or a few nucleotide mutation, 那么
最方便的应该是直接order single stranded DNA, 长度 ～ 100 nt. Homology arms >
40 nt 就足够了。
如果是要knockin比较大的insert，比如说GFP reporter，那么可以需要克隆到质粒上,
homology arm > 500 bp，就可以了。可以有antibiotic selection，也可以不用，取
决于你的效率。 效率低的情况用antibiotic selection，之后还需要一个step，用cre
-loxp把antibiotic selection cassette给去掉，否则在很多情况下会影响你gene的表
达。
在两种情况都要... 阅读全帖 |
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t******k
发帖数: 599 | 16 在克隆grna的vector，好不容易有一个colony测了发现在最后接近g的15bp左右地方少
了一个bp，想问问这个u6 promoter对grna表达会有影响么？发现克隆的不同grna都有
这个deletion，要哭死了。。 |
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d********f
发帖数: 43471 | 17 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mahmet (里约大冒险), 信区: Biology
标 题: 知识分子独家专访：面对质疑的韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Oct 17 21:05:25 2016, 美东)
独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之... 阅读全帖 |
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o**********n
发帖数: 2 | 18 我目前在做lncRNA，现在有的plko系统感觉效率不是很高，想用CRISPR系统来试试？
有没有哪位高人指点一下如果要使用CRSIPR去knock out或者knock down 某个lncRNA，
应该怎样操作呢？
如果在该lncRNA的启动子区域选择位点可行吗？但是又要怎样选择gRNA的序列呢？
或者是不是可以在该基因的两端各设计一条gRNA把它整段剪去呢？
谢谢各位，欢迎讨论 |
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j******i
发帖数: 939 | 19 克隆狠容易拿到。gRNA成功率很高，但是不同的loci效率有不同，一般设计三个gRNA，
挑其中效率最高的用。off-target是没办法的，或者用double nickase吧, 不过效率会
降低。筛选克隆的过程是麻烦了点，费时费力，一般用gfp, puro,来enrich, 不过都不
是最好的方法，各显神通吧。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 20
你是不是说用TAT一类肽引导进去？发一篇文章没问题。但是我个人觉得没多大优势，
因为现在已经把cas9和gRNA做到一个载体里面了，即使你把蛋白直接弄进细胞，还是要
转染gRNA的plasmid。 |
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i*****i
发帖数: 154 | 21 可不可以先做一个Cas9稳定表达的细胞，然后把gRNA像siRNA那样transfection进去？
理论上差不多，gRNA是单链，siRNA是双链。 |
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s********n
发帖数: 248 | 22 每个locus/每个基因不同gRNA target效率都有所差别，如果想合成RNA用来打老鼠，可
以先在N2a 细胞里测试一下gRNA target的效率，再选择target效率高的用来打老鼠。 |
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p*******i
发帖数: 449 | 23 最近在用CRISPR来删除一部分基因组，就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。
其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了，只说一个问题：
我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然
后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。
CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA
CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA
具体序列保密，不方便透露。 两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。
我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点。 如果
我做的是瞬转， 这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切？ 如果如此，是不是大
大降低了我得到正确克隆的可能性？是不是可以解释为什么我重复4 5次，筛几百克隆
无一正确的原因？
请大家讨论指教，非常非常感谢！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 24 就是告诉他们一个位点，公司做几条gRNA，然后测效率告诉你那个最高
gRNA的质粒刚收到正准备转细胞
就是图个省事，花个几百块钱，设计构建啥的都不用管了，拿到手的质粒马上就能进细胞
往下做cell line的全套报价都是大几千，觉得太贵了划不来，就自己慢慢做了 |
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T****a
发帖数: 409 | 26 我最近刚开始在做这个，强烈推荐这个网站。
http://tide.nki.nl/
我是将gRNAs连接到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒里，然后将连接成功的CRISPRs plasmid转
染到细胞中，再sort GFP positive cells for culture (sort 50,000 cells for 1
well in 12-well plate。等差不多长满了，取genomic DNA，PCR，再用PCR primer
for sequencing。
如果一切顺利，出来的sequence file应该是从gRNA起作用的地方开始有chaos。将
sequence file和guide sequence upload上去，这个网站就会很快计算出来mutation
percentage。 |
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C****n
发帖数: 79 | 27 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 28 v2上直接改的好像没有。类似的，Zhang Feng有一篇发cell上的lentiCRISPR-EGFP, 只
不过gRNA不在同一个载体里边。14年, NBT上有一篇做老鼠模型的，cas9-gfp-gRNA全在
一个lenti载体上。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 29 关键是她用的NHEJ诱导突变，这是CRISPR里最简单的一种。copy number对gRNA来说没
影响啊，只要你往细胞里加足够多的gRNA，总能全部target吧。
我看过别人用CRISPR做Megabase尺度上的inversion，deletion，duplication构建小鼠
疾病模型的paper，那才牛。
wonder |
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O**********a
发帖数: 317 | 30 v2有两种，一种是cas9和gRNA分开的，先建stable cell line表达cas9，再用lenti-
gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：大谢！
：
：........... |
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m*********D
发帖数: 1727 | 31 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
所以，就想自己试试。
谢谢！
gRNA |
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b*****s
发帖数: 169 | 32 gRNA是和靶部位配对互补的吧，你给予的量其实是非常大的，一个部位有很多gRNA在等
着配对呢。 |
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O*****l
发帖数: 97 | 33 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。 |
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j******i
发帖数: 939 | 34 1. 对于基础研究，Cas9／gRNA比NgAgo/gDNA好用多了。既可以用病毒deliver，也可以
用瞬时的RNP；既可以体外用也可以体内用，还能加个筛选标记。
NaAgo当然可以用DNP deliver，但很难用病毒deliver. RNP/DNP在细胞系效率还行，在
干细胞中就困难了－不是转不进去就是死一大片（电转）。所以对于难转的细胞或者转
体内，还是得依靠病毒载体。还有，小片段的DNA可能被基因组捕捉，造成‘off-
target’; gRNA就没有这个问题了。
2. 对于临床，无论cas9/cpf1还是NgAgo对于zfn/talen就没什么优势，甚至是劣势了－
因为临床只要有几个好用的核酸酶就够用了。反而细菌蛋白诱导免疫反应的可能性比较
大。临床上走在最前面的是zfn. 最近还有用病毒载体装载zfn上病人的临床了，所以不
用太害怕病毒载体，害怕来自不了解。
事实上，对于基因治疗，基因编辑能不能最后取代病毒载体还是个疑问呢！慢病毒载体
就比很多人想象的要安全，而且慢病毒基因治疗药物马上就要出来了－这还不包括car-
t呢。
3. i) 诺奖要是给整个基因编辑领域发，那N... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 35
"rna的特异性／稳定性应该也是比ss－5p－dna好的" ???
这个你恐怕是搞错了吧？ gDNA 就是长度２０多的"ss－5p－dna"，说穿了其实就是５
端磷酸化的oligo primer。这个东西稳定得一塌糊涂，在室温下放上几个星期都妥妥的
，但是我可是不敢这么放RNA的。
这个方法的优点就是gDNA 可以直接合成，而且很稳定，对于不用病毒的体外瞬转非常
合适。但是对于gRNA, 这么搞就很麻烦，首先是因为环境中到处都是RNase，连培养基
的血清里都有很多RNase，我虽然没有亲自做过这个实验，但是可以猜想到这个肯定需
要很小心的清洗。
当然缺点就是这个gDNA东西很难直接用病毒来当载体。虽然也有酶是可以合成单链DNA
的，但是不能合成那么短的一个片段。 所以我觉得这两者的优缺点正好是互补的，
gDNA 更适合混合蛋白酶来一起瞬转，gRNA适合用病毒载体来用质粒转。 |
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g****g
发帖数: 74 | 36 哈哈
那是你做rna做的太少了，其实二级结构的rna那时非常稳定的，好多时候稳定的像石头
一样，根本不像大家想象的那么娇气，怕这怕那的，尤其是像grna这种的。不敢说放几
个星期，至少一个星期，那是绝顶的没问题的，要是放－20度，一两年内，反复冻融后
活性也是刚刚的
其实grna的合成，如果用试剂盒来做的话，一个下午合成／纯化几百个sg rna绝对没问
题啊，唯一的问题就是可能试剂盒贵一些
再者，如果用分开的cr rna 和 trace rna的方式，高通量合成cr rna那也是不成问题
的，好多公司都有这个service的
DNA |
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S**********e
发帖数: 620 | 37 她的话本身没太大问题，是她的风度和自身修养很差劲。
RNA除了转录以外有很多比较肯定的功能，但是DNA就没有RNA那么多那么清楚。从传统
观念上看，如果DNA能做RNA一样guide的事情，那其实意义很深远。问一个外行的问题
。不知道gRNA结构上和gDNA差多少，是不是要把gDNA打扮成gRNA才行？ |
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发帖数: 1 | 38 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 39 思路挺好的，我也非常同意通过挑无数克隆再去做genotyping的工作量是非常恐怖的。
我不知道你是在思考这个strategy还是已经付出实践。如果你做的是human ESC，根据
我们实验室以及我一些朋友的经验，通过FACS把单细胞sort到96孔板里，即使全程都加
了ROCKi，存活效率非常之低，低得令人发指，和mouse ESC完全不是一个数量级的。我
的经验是大概一个96孔板能活5个左右，但是还不能确定karyotypes是不是正确的，以
及可能的假阳性。我更倾向于推荐使用drug resistent markers，比如一个puro，一个
neo。虽然neo的假阳性偏高些，但是single cell colony的survival要好非常多。同时
可以像你原本design那样加一个negative selection marker，比如GFP。
还有一个可能对你有用的hint是：可以设计两个gRNA去切除一段genomic DNA，然后只
用一个引入point mutation的donor （带puro）去做homologous recombination。可以
现在293细... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 40 独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之久，至今虽有多方表态，但仍然没有迹象显示很
快会得到解决。如何在学术规范下寻找解决之道，是摆在中国科学界面前的重要挑战。
10月10日晚，12位科学家实名呼吁调查（后增加一名科学家），《知识分子》
当晚连线韩春雨，并于第二日中午赶赴河北科... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 41 科学讲究的是实事求是。
这个研究就是杨开了个做CRISPR的公司，然后针对病毒PERV的Pol设计了一个gRNA，然
后在猪源细胞系里做最简单的CRISPR。反正60多个PERVcopy都一样，target一个跟
target所有copy没区别，所以他们成功地一下子把细胞系里所有的PERV Pol都敲掉了。
这些全部都是纯技术，还不是特别难的那种。他们唯一做的一个具有生物意义的实验就
是把这个敲掉病毒的猪细胞跟人细胞在petri dish里混一下，然后看人源细胞会不会感
染病毒。
这篇文章主要是为公司做托，真正的biological significance很小。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 42 CRISPR本身就不是genome editing的唯一方式。但CRISPR是最近发现最高效的手段。用
AGO的好处是gDNA比gRNA特异性高。 |
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w********2
发帖数: 632 | 43 crispra也有off target cutting，现在dodner和张峰都在解决这个问题，一是grna的
特异性（这个我认为不是大问题，4的20次方还是很特异的），还有cas9蛋白的切点空
间拓扑结构，这个我认为是个问题，但可预测性比较大，基本就在那几个碱基对附近，
还有就是免疫反应，这个机制大家都不清楚，是个不可预知的大问题。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 44 贺的人体实验完全逃避了一个关键问题，嵌合率。搞transgenic animal的都知道，这
种基因改造一代大概率是嵌合体，即只有部分组织细胞的基因组是目的基因组。我们千
老都知道，转基因动物得再筛一两代才能得到纯合子。露露娜娜可能皮肤神经有CCR5突
变，但消化道内脏血管没突变，本质上还是没有抗艾滋能力。我们千老设计的CRISPR好
歹还知道搞个marker标记哪些组织突变了，他就靠一个gRNA通过非同源重组诱变，一点
技术含量都没有。生物盲们别不懂装懂瞎吹了，歇着吧。 |
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Z**********g
发帖数: 14173 | 45 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: xiaxianyue (下弦月), 信区: Joke
标 题: 本钱老来点评基因编辑人类实验
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 30 14:48:36 2018, 美东)
刚花了半小时码了个长文，丢了，生无可恋……先占个坑。
你们，包括什么杀生丸都没说到重点。
先说一下贺的逻辑吧。多方证据显示携带CCR5delta32突变的人具有抗艾滋能力。而最
近大热的CRISPR/Cas9 genome editing技术使科学家现在有了“相对”定向修改DNA序
列的能力。所以利用CRISPR制造含有CCR5突变的人，会使该人获得抗hiv的能力。
这个逻辑门外汉看着会觉得相当很合理。很多在生物学界分一杯羹的物理/工程学家也
确实是按这个逻辑搞钱搞文章。可惜，贺还有贺的老板都缺乏真正的生物学背景。他们
和生物学家合作的时候没问题，但当他们自己开始搞生物，就会搞出大篓子。如果他们
在小鼠或者猴子里做这个实验，也就发一个二三流paper。但是他们野心太大，居然先
斩后奏做了人体实验。
接下来分几个点讲这个实验为什么破绽百出狗屁不通。
首... 阅读全帖 |
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S*******l
发帖数: 4637 | 46 gRNA设计好，那么长病毒RNA单链切点那么多，还怕个别点变异。
一进去咔咔咔都切成一堆碎片儿了。
只要有病毒序列，马上就有特效药。
小分子要根本不赶趟。弄出一个来要十几年，我这个一个礼拜就量产了。 |
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发帖数: 1 | 47 转贴，非原创。
简言之，麻省理工的张峰三年前研制出世上第一把剪刀，河北科大的韩春雨刚刚造出第
二把，都是用来精准剪裁DNA的。分子生物学界苦苦寻觅之近半个世纪并公认希望万分
渺茫，所以被称作生物学界划时代的革命性壮举。无意外的话，不出五年应冠以生物医
学诺奖。
为什么小小剪刀如此轰动？
那得先说说人是啥。人不过是30几兆细胞堆积而成的生命体。而决定我们的呼吸心跳相
貌行为甚或思维乃至手里的教鞭质量，正是细胞。准确地说，是细胞核里的基因组。始
于来自五湖四海却能奇缘般地汇聚于此海角天涯有幸群侃神聊，大概也离不开我们基因
组里一些共性的。
那么，基因组又是什么呢？
基因组是一根由两条超长的脱氧核糖核酸即DNA交缠而成的双股长绳。其组成极其简单
，仅由4个不同的碱基即ATCG串联而成。准确地说，一股上的A或C与另一股上的T或G双
手紧拉配对从而形成双股DNA间的绝对互补缠绵，以确保遗传密码之精确无误，人人完
美，好人一生平安。
其实ATCG没有那么安分专情。先把它们比作♦A♥A♦2♥
2，看看他们是怎样开小差的。比如♦A偶尔会很无情... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 RE LZ
Did you note that some organism, anti-sense RNA likes RNAi can assist target
protein trans-splicing.
if not , pls go to one
2011 PhD dissertation of Université de Montréal
by Yan YF
pdf web link:
HTTPS double dot //papyrus.bib.umontreal.ca/xmlui/bitstream/handle/1866/5423
/Yan_Yifei_2011_memoire.pdf?sequence=5
its pp24:
>Does anti-sense mRNA assist trans-splicing?
A mechanism was recently identified in the ciliate Oxytricha trifallax
where larger RNA molecules are used as templates to dir... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 49 ZFN, TALEN, CRISPR我都在用。挑最喜欢的，还是ZFN，因为他小，很容易放到viral
vector里边。但是它贵啊，自己合成的话，成功率又不高。TALEN克隆费力了一点，不
过熟练的话，一周就能拿到了。CRISPR定oligo, 克隆，怎么也要一周了吧。TALEN的专
一性很好，CRISPR的潜在off-targets一搜能搜出一大堆，吓死人。
shRNA是RNA识别RNA, CRISPR是RNA识别DNA+cas9识别DNA, 所以你不能简单的说都是RNA
guide. Cas9没有gRNA就没有办法cut on target了。当然，不知道cas9本身有没有细
胞毒性。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 50 请教楼上高人，
1)利用几个大实验室的在线设计工具，设计三个gRNA，构成三个载体，转染细胞。假定
转染效率不是瓶颈，这个一般是不是直接做realtime或者western挑一个效果最好的就
用了？还要不要做off target检测？我担心的是三个里面还没一个效果满意的。
2)如果我跳过筛单克隆这一步，转染后加药稍微筛一下，然后直接进入下游实验。这个
情况下效率会比siRNA更好吗？
谢谢！ |
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