c*******y
发帖数: 1657 | 1 后来又做了一次
常温二水氯化钙很易溶于HBSS溶液
过滤后打算常温放置了
之前的溶液白色，是在搅拌加热情况下发生的
二水氯化钙溶解后，在4度冰箱放置较长一段时间有白色粉末析出，特别是瓶壁上
查了所用的HBSS内有磷酸氢钾、磷酸氢钠，硫酸镁，碳酸氢钠成份
所以白色的东西可能是磷酸钙、硫酸钙或碳酸钙
多谢大家有益的讨论 |
|
b**********8
发帖数: 349 | 2 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
|
|
n*********s
发帖数: 552 | 4 谢谢答复，不过不是BAL，就是貌似注射器灌好hbss，然后从心脏打进去，hbss从心脏
进入肺里，肺就鼓起来了。是要去掉red blood cell吗？那为什么不用RBC lysis
buffer呢？ |
|
f******s
发帖数: 440 | 5 我们用EDTA in HBSS to obtain cells
然后数
你还要继续分的话，用Ficoll-Paque gradient?
再要提macro的话，FACS sorting？ |
|
c******e
发帖数: 350 | 6 面对众多的缓冲液，不知选择的根据是什么。
RNA用MOPS，southern/northern blot用SSC, 细胞培养相关的有Hank's buffer saline
(HBS), HEPES.
请问，在同一PH值下，选择这些buffer的根据是什么？
比如，HBS，HEPES， HBSS什么的，用哪一个？
RNA为什么用MOPS？
多谢！ |
|
c*******y
发帖数: 1657 | 7 配置25mM氯化钙HBSS溶液
为什么氯化钙溶解后是白色的呢？
记得以前配过，是无色的
但是为什么放置一段时间后有白色颗粒析出？ |
|
r***e
发帖数: 2539 | 8 HBSS中有微量的磷酸根吧，
那加了氯化钙不就沉淀了？和做磷酸钙转染一样。 |
|
O***n
发帖数: 13127 | 9 do not use your staining buffer with nan3 if you want to sort cells, just
use pbs with 5% fcs or HBSS with 5% fcs; large volume wash once. sort cells
into tube with fcs
plate
Ca2+ |
|
r***e
发帖数: 2539 | 10 pellet里当然有病毒颗粒了，但是绝大多数是死细胞碎片，不知道你有没有离心两次，
第二次用20%蔗糖cushion，能改善一些，但是不多。
两次离心完了，我是用HBSS重悬后，用枪头吹100次，然后EP管10000rpm离心15秒，取上
清，把大多数碎片去掉。一般的hamilton syringe不会堵。
吗？ |
|
T****u
发帖数: 424 | 11 rapamycin
Torin1
EBSS
HBSS
效果都不太一样。
drug浓度不一样，结果也不一样。
1. 用compound，一般compound都有各种off-target，纯在multiple effects
2. 简单地说autophagy有点笼统。
不同的marker表征的不一样，initionation or completion or others.
LC3-II先增加，但会recycle
这一点上不同drug，dosage不一样看到的结果也不一样。
还是看p62 or long-lived protein degradation
lysosome |
|
z*t
发帖数: 863 | 12 HBSS+%2 FBS works well for BD |
|
