h*******g
发帖数: 711 | 1 Currently we are studying the function of a channel by exogenously express
it into HEK293T cells. However, in our HEK293T cell-line, it seems that
the background current is so huge, ~10 nA. I'm wondering whether your guys
also observe this phenomena? |
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c********n
发帖数: 225 | 2 对于韩春雨NBT文章无法重复的问题
需要从Figure 1 开始一步步看
作者的contributions
1. C.H. conceived the study and designed the experiments.
文章 “Story” “Idea” 的设计与发起人
2. X.Z.S. provided intellectual advice on the project and experimental
design.
实验设计， “One guide-faithful” -Figure 2d？
3. C.H. performed mammalian genome editing.
（Figure 4,5）
文章里让科研界最感兴趣的结果，也是无法被重复验证的主要问题
4. F.G. performed the BLAST search and the in vitro cleavage experiments.
（Figure 1, supplementary figure 2）
大肠杆菌E coli 表达的蛋白
NgAgo 基因编辑功能的初步 in vitro 数据支持
注... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 3 【再贴一次】
对于韩春雨NBT文章无法重复的问题
需要从Figure 1 开始一步步看
作者的contributions
1. C.H. conceived the study and designed the experiments.
文章 “Story” “Idea” 的设计与发起人
2. X.Z.S. provided intellectual advice on the project and experimental
design.
实验设计， “One guide-faithful” -Figure 2d？
3. C.H. performed mammalian genome editing.
（Figure 4,5）
文章里让科研界最感兴趣的结果，也是无法被重复验证的主要问题
4. F.G. performed the BLAST search and the in vitro cleavage experiments.
（Figure 1, Figure 2？，Figure 3a，supplementary figure 2）
大肠杆菌E coli 表达的蛋白
NgAg... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 4 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
共计13则
细节请参见
Date：2016年10月10日
Title：13位科学家实名呼吁对韩春雨启动调查：为了中国学界的名声
Link：
http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1541143_1
增加实验细节请参见：
Date：2016年10月11日
Title：【赛先生】13个课题组实名声明：无法重复韩春雨实验
Link:
http://chuansong.me/n/943170546756
其中， 根据一些实验室数据推论，“NgAgo或许不具备双链DNA切割活性”
“北京大学生物动态光学成像中心研究员孙育杰的实验室专长荧光成像。。。。孙育杰
进一步解释：端粒有一个特点，它有数千个重复片段，如果用CRISPR或者TALEN这样的
技术去target（靶向）端粒的重复片段的话，由于它有上千次重复，数百、上千个
CRISPR或TALE会富... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 5 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
共计13则
细节请参见
Date：2016年10月10日
Title：13位科学家实名呼吁对韩春雨启动调查：为了中国学界的名声
Link：
http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1541143_1
增加实验细节请参见：
Date：2016年10月11日
Title：【赛先生】13个课题组实名声明：无法重复韩春雨实验
Link:
http://chuansong.me/n/943170546756
其中， 根据一些实验室数据推论，“NgAgo或许不具备双链DNA切割活性”
“北京大学生物动态光学成像中心研究员孙育杰的实验室专长荧光成像。。。。孙育杰
进一步解释：端粒有一个特点，它有数千个重复片段，如果用CRISPR或者TALEN这样的
技术去target（靶向）端粒的重复片段的话，由于它有上千次重复，数百、上千个
CRISPR或TALE会富... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 6 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
项目 结题
date： 2017年8月2日
updated: 2017年8月4日
Note2017080401: added a few notable reviews/summaries
---------------------------------------
- NBT retraction note：
http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#correction2
原文引用
“Retracted online 02 August 2017
We are retracting our study because of the continued inability of the
research community to replicate the key results in Figure 4, using the
protocols provided in our paper. In this figure we report that the
Natro... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 7 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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v*******e
发帖数: 961 | 8 关键词：Solid Lipid Nanoparticles, nanomedicine / nanocarriers, DNA release,
endosomal acidification, HEK293T cells
请把你的姓名，单位email及简介（一两句话，第三人称）发我站内信箱。谢谢。 |
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z********i
发帖数: 610 | 9 之前总是听到华人BT老板，心里也很害怕，尤其我自己也找了一个中国老板。来了之后
才发现人很好，一点都不push，他只是偶尔来实验室找人talk一下，实验室人不多，两
个人都有绿卡了。实验条件很好，并且告诉我不要省钱。
想想我在国内转HEK293T 用磷酸钙，这里想用什么转都可以。去别人实验室借了一瓶
FBS，在国内的时候只用国产的血清和Hyclone,我还以为自己借的那一瓶是很好的血清（没办法太土了），回来后被告知，这个是很差的一个牌子，我们实验室从来不买。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 MEF, REF, HEK293T,Hela, PTK2, B16F10, eptherial cells... |
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S*****s
发帖数: 287 | 11 谢谢楼上各位。我正在看这方面的文章，特别是七楼 jcb 老兄列出来的那篇，越看越
觉得不错。我做的蛋白目前没有 endogenous cell line，而我研究的方向也包括 mRNA
intron splicing。现在我都是用引入了 CMV promoter 的 BAC DNA 做 transfection
。看看这些文章我倒是想买点这个 ZFN 然后把 HEK293T 细胞的基因组改一改，改造出
一个可以 endogenous cell line 来。明天和 sigma 的 rep 继续谈谈。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 晕，这也太奇怪了！
我们和隔壁实验室用的是HEK293T， MEF， HEla， 真的就是一点都没有用！
但是这个药品不应该挑细胞系的，而且我以前用的时候一直好好的，那三个细胞系都可以
的，就是这个新来的药品突然一下子就不能用了 |
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L**********O
发帖数: 1761 | 13 我用HEK293T细胞，FIREFLY读数大概是２００００００，RENILLA读数大概是4００００
０。
但是我必须用osteoblast做实验。。FIREFLY读数大概是６０，RENILLA读数大概是２５
０。。
一开始怀疑是transfection的问题. 我用的是Lipofectamine。转染GFP以后，镜下观察
转染率大概50％。。
不知道该怎么改进了～～ |
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a*******u
发帖数: 19 | 14 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 15 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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C*****h
发帖数: 926 | 16 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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e***o
发帖数: 344 | 17 各位大虾不知是否知道怎样使转到in vivo 的质粒/基因的copy number增加。最好是使
单copy的增加到上百个。在HEK293T cell line 里的sv40可以使 copy number 增加。
不知道可不可以把这套系统用到在神经系统里。什么方法转基因都可以。virus
infection, in utero-electroporation等等。
谢谢！ |
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e***o
发帖数: 344 | 18 没人做过类似的？ 要是能把HEK293T的系统搬in vivo 就好了 |
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e***o
发帖数: 344 | 19 HEK293T expresses SV40 large T antigen, amplifying transfected circular
plasmids harboring SV40 replication origin. |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 如果你要转的是类似Hela, HEK293T 这些大众化的细胞的话，
我亲手做过，用lipofectamine能转。如果你担心内毒素的话，
在做miniprep 的时候额外多洗两次（一次用buffer PB,
然后70%ETOH 洗的这一步多洗一次）
唯一要注意的是大部分mini-prep 出来的质粒浓度比较低，
如果浓度太低（低于50ng/ul) 的话要浓缩。
和线性，而maxi的去除了内毒素，且 |
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c**i
发帖数: 265 | 21 我在做一个RNA tethering assay in HEK293T，ORF1-stop codon- aptamer -KOZAK
-ORF2.
理论上ORF2蛋白是不应该表达，由于在终止密码子之后。但实验表明ORF2蛋白有表达，
并且表达量和转染的质粒量成线性关系。请问大家有没有这样的经验？十分感谢。 |
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s*******g
发帖数: 64 | 22 我的细胞养在载网上总是死，没有载网的对照却活得很好，不知道什么原因呢？
我用的铜网，先铺了Formvar，UV照了两小时后铺poly-d-lysine，洗干净后在上面养神
经元和Hek293T细胞，都死了，但没有铜网的一组却没事。这是什么原因呢？请大家帮
忙想想，多谢多谢 |
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f*******d
发帖数: 92 | 23 虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line， 做之前请教一下做
过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid， 怎么选择位点呢？酶切之
后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
谢啦～ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，没有
磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，就
有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
----------------------------------------------------------
Jan Winter
5:34 PM (1 hour ago)
Hi guys,
Just had a couple of tests with ngago from addgene and custom Oligos, so I
did not try to reproduce the paper.
And in my hands I see an effect that is slightly ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 25 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 28 实例记录 - 第三类信息， 第四例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Nay Chi Khin, Jenna Louise Lowe, Jensen M Lora, Gaetan Burgio
- 发布时间：2016年12月6日
- 发布平台：bioRxiv
- 发布方国家：澳大利亚
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
John Curtin School of Medical Research, the Australian National University
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 29 实例记录 - 第三类信息， 第四例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Nay Chi Khin, Jenna Louise Lowe, Jensen M Lora, Gaetan Burgio
- 发布时间：2016年12月6日
- 发布平台：bioRxiv
- 发布方国家：澳大利亚
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
John Curtin School of Medical Research, the Australian National University
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 30 转BioArt
4月4日，Nature在线发布了一篇题为“Compass protein attracts heap of criticism
”的新闻报道（News），文章直指磁受体蛋白相关研究目前面临的巨大争议。
2015年11月16日，北京大学生科院谢灿课题组在Nature Materials杂志在线发表论文，
声称首次报道了一个全新的磁受体蛋白（MagR），当时众多媒体报道该突破性进展或将
揭开被称为生物“第六感”的磁觉之谜，并推动整个生物磁感受能力研究领域的发展。
值得一提的是，该成果还获得2015年度“中国生命科学十大进展”。与此同时，当时还
在清华大学的张生家课题组2015年9月14日在Science Bulletin（科学通报）发表论文
声称利用Isca1（MagR）蛋白开发出了一种磁遗传学工具（磁场诱发神经元的相关活动
）。
诚然，此后围绕磁受体蛋白或者磁遗传的引发了一次中国学术史上罕见的争论，至今尚
未平息，BioArt这里不再赘述。回到Nature刚刚发布的报道，文中提及了今年3月16日
，来自清华大学医学院鲁白实验室联合北京大学生科院谢灿实验室在Frontier... 阅读全帖 |
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z*******9
发帖数: 112 | 31 我想用CRISPR直接tag host蛋白。我的细胞是HEK293T。想问各位推荐一个直接高效的
protocol。
谢谢 |
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d********r
发帖数: 3279 | 32 no way. there is almost no background currents in HEK cells. You must did
something wrong on your recording setting. |
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h*******g
发帖数: 711 | 34
HEK cells. You must did
I know there couldn't be. Nobody shows a big current
in any paper. However, it is the case at least in our
cell-line....... |
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h*******g
发帖数: 711 | 35
transfected NMDA subunits with Glu/
current?
No, actually, we did not do any treatment on the
cell, and just record IV from -100 to 100. |
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h*******g
发帖数: 711 | 36
Not really, cos there is a reversal potential less
than -40 mV observed in the IV curve. I don't think
leak can do this. Besides, this current is vanished
after transfected with our target channel...... |
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i***R
发帖数: 663 | 37 Do you think K is charge carrier or Cl ?
Why don't change your ex solution composition to figure out.
Still, 10nA is Very high. We never see such current in blank HEK cell.
There is 100pA background current at most.
If you are not sure about your HEK cell. The easiest way is to get some
other HEK cell from other lab or ATCC. |
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h*******g
发帖数: 711 | 38
】
figure out.
current in blank HEK cell.
easiest way is to get some
First, I would like to thank you for your good
advice. I have used NMDG+ MSA solution. However, the
current is still there, which is really wired.
Anyway, we have ordered a new line from ATCC. Hope
this can solve the problem. |
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l******8
发帖数: 1691 | 39 That's very confusing.HEK cell should not behave like this.Most likely there
is something wrong in the setting, not in the cell line.
First of all, you said the Vr is < -40 mV, assuming the Vr is -50 mV, so, at
-50 mV, you have 0 current, right? Then, at what holding voltage did you
get a -10 nA current? You said this is the background current, so I assume
it is not depolarized.
What is your noise level (peak to peak)? Also, it would be helpful to know
your depolarizing step size during membrane... 阅读全帖 |
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h*******g
发帖数: 711 | 40
like this.Most likely there
cell line.
assuming the Vr is -50 mV, so, at
holding voltage did you
background current, so I assume
would be helpful to know
and the resulting current
Thanks for your comments.
First of all, we are not handling the voltage-gated
channel. Plus, it seems that the background current
is not voltage-dependent because the IV-curve is
linear. The 10 nA I mentioned is under a holding
potential of 80 mV.
The noise level in our system is about 2 pA,
measured by the Irms. And ... 阅读全帖 |
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l******8
发帖数: 1691 | 41 I have many questions.It seems that you do not have an experienced
electrophysiologist in your lab to consult
Maybe you have a good reason, but why do you hold the cell at 80mV, instead
of something like -60mV? You are whole cell clamping, not in cell-attached
mode, right?
When the other person asked you whether it could be a bad seal, I think you
should say what your seal resistance is, instead of inferring from your Vr. |
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