b******r
发帖数: 111 | 1 These days, almost make me desperate to death. As a 2-year post-doc,who did
lots of cloning, I fail to do such an easy work. Isolate mouse genomic DNA
by phenol/chloroform,75%ethanol precipitation. Then digest by HindIII
restriction enzyme as follows:
genomic DNA: 2 ug,1ug,and 0.4ug;
HindIII enzyme: 70 units(3.5ul,and different units);
Buffer: 5 ul
add water to 50ul
37 degree for 10 hours. Run gel.Genomic DNA is still a strong band, not
smear at all. I have try HindIII from NEB and Roche com... 阅读全帖 |
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b******r
发帖数: 111 | 2 I have done '用chloroform 再洗一次，75% ethanol 再沉淀。',but yield is too
low.
Can I do this:
add NaAc(0.1 volume of genomic DNA), mix,then 2.5 volume of 100% ethanol to
precipitate again? The question is: does a little NaAc still stay in
purified genomic DNA and inhibit digestion of HindIII? |
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g*****n
发帖数: 250 | 3 The question is: does a little NaAc still stay in
purified genomic DNA and inhibit digestion of HindIII?
Maybe. You can use a large volume (e.g., 0.5 ml) of 70% ethanol to wash the
DNA pellet. |
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b*****o
发帖数: 150 | 4 Should be pretty easy. What's your mean "每次都连得稀奇古怪的"?
Is your 2000bp DNA fragment PCR product? or released from another vector?
Are KpnI and HindIII very close to each other? Provide more information if
you really want to get help |
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x**2
发帖数: 255 | 5 最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
谢谢！
由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
我要插入的片段是：
EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双
酶切鉴定好像是自连质粒（虽然我双酶切的载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体）。
个人认为不是双酶切载体的问题，因为：1，EcoR1, Xba1两个酶切位点相隔50bp；如果只
有一个酶切动了质粒那么应该会有很多自连载体，而我的板子上只得到两个点。
我测序鉴定过载体 |
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c**A
发帖数: 1474 | 6 first of all, everything could happen in biology.. hehe..
so, for trouble shooting:
1. run gel to check your sample before digestion but after
purification.
OK --> digestion problem
smear --> purification problem.
2. if purification problem, try to use a PCR purification kit.
3. if digestion problem.
A. make sure the fragment you cloned did not contain any
HindIII/EcoRI
B. try a sequencial digestion..
4. just a reminder:
HindIII will have prolbem to cut when your si |
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c*******o
发帖数: 8869 | 7 digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sur |
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b********9
发帖数: 1061 | 8 最近一直在做cloning,一个3Kb, 一个2Kb，一个8Kb，连在一起，酶切为点：pstI,
HindIII, and NotI 怎么连也连不上，已经做了2个月了，哪位大虾帮帮忙？
3Kb: pstI and Not1
2Kb: notI and HindIII
8Kb: PstI and Hind III.
多谢。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 9 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
每个fragment大概0.8-1.1kb
然后我做的是pUC19 50 ng,
pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
总体积15-20 ul
ligate 20 hrs
然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
涂100-200 ul/平板
然后挑克隆
用colony digestion筛选
一起做了五个ligation
一天筛了近90个克隆
每个ligation都筛出正确的了
然后这些positive的提质粒出来
用不同的酶切再确认一下
然后测个序（或者不测）
直接PCR的切就行
不过我个人比较喜欢的是每个片段先做到TOPO里面（pBluntII)
先测序
挑序列正确的再酶切、胶纯化，往下做
这样每一步都是正确的序列
最后终产物酶切什么都对的话不测序也没关系
不然如果... 阅读全帖 |
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w*****m
发帖数: 414 | 11 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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b*******0
发帖数: 1695 | 12 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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d**b
发帖数: 1286 | 13 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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m*******r
发帖数: 13263 | 14 发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期---zt
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来呀!把这个孽鬼绑上柱子!
生物博士：上... 阅读全帖 |
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X***h
发帖数: 74 | 16 ft，template值钱啊。
用的是SacI HF和HindIII。 |
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x*****e
发帖数: 309 | 17 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对 |
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c****9
发帖数: 95 | 18 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
做酶切呢？谢谢。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 19 BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
u run into a difficult but rather common problem...how did u do your
digestion? Have your checked NEB
appendix about it---the correct one would be digest with HindIII first and
then digest with BamHI,
otherwise, your chance of success is very low...That said, I would always
try to avoid this situation...go with
different enzyme cute sites, fusion PCR, homologue based cloning, or blunt
ligation(nowaday very
easy)...For a beginner, I hope to remind one truth: virtually for ... 阅读全帖 |
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a*****y
发帖数: 277 | 20 楼主，可否考虑：
设计一对点突变引物，把篇pQE8的bamhi和hindiii之间加入数个碱基，就好切了。因为
差一个碱基是比较难的。那样以后实验室要构建，也好些。
或者，你不是有一个篇pQE8中已经做好的克隆吗，就用那个作为你的载体，应该超级好
切了，切了以后回收大片段，非常easy的事情。反正你要测序，不怕是那个你已经做好
的克隆。如果那个做好的克隆和你要克隆的片段大小不一样就更好了，测序前做个酶切
跑个胶就好了。
最好是第二方案，马上可以动手。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 21 定一对probe改造一下就可以了。
比如 pQE70酶切位点是 EcoRI-BamH1-Hind3. 你可以定一组probe，anneal后两边分
别是EcoRI 和 Hind3的位点，中间有BamH1但是和HindIII用4 5个bp隔开。然后把
construct用EcoRI 和 Hind3酶切--连接，以后用就很方便。 |
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g******1
发帖数: 244 | 22 买点兰姆达DNA用HindIII酶切，有现成的图谱比对 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 Lambda DNA / HindIII 是一个常用的分子标记。但是分子量没有你说的那么小。
小分子量的还是用你老板说的方法比较实用，而且可以弄到很小的片段 |
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A*******e
发帖数: 284 | 24 Lambda DNA / EcoR I and HindIII double digestion, very good marker |
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d****i
发帖数: 2346 | 25 promoter + kozak + ATG + ATG后面4-5个(甚至是10个左右的氨基酸序列) + 合适的酶切位点(如果可用HindIII似乎好一点) + 你的目的
蛋白(无ATG且in frame) |
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s******s
发帖数: 13035 | 26 你试一下column based的方法抽gDNA吧。我怀疑是不是蛋白没除尽，或者
有phenol残余。
did
not |
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h******y
发帖数: 351 | 27 1. 你抽提的DNA有问题。
2. 试试其他酶，例如EcoRI
by the way, 你用的酶量太大。
did
not |
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g*****n
发帖数: 250 | 28 有phenol残余的可能性大。用chloroform 再洗一次，再沉淀。 |
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b******r
发帖数: 111 | 29 Thanks. Can you tell me the name of 'column based' purification of genomic
DNA? |
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g***j
发帖数: 40861 | 32 怎么把一个2000 多的片段连到一个7000多的载体上，每次都连得稀奇古怪的？ |
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g***j
发帖数: 40861 | 33 是应该很简单啊
2000的片段是从别的质粒上消化下来的
两个酶切位点在载体上相距800吧
每回连出来的质粒都比消化过的载体还小，每回还都不一样。
我就奇了怪了。 |
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b*****o
发帖数: 150 | 34 我有一同事，从一个要来的载体上双切连一个片段，却怎么也连不上。一会认为酶有问
题，一会认为KIT有问题。我建议他首先搞清楚是不是还有其他的酶切位点，就是是否
是特异的一个切点。不要完全以来于提供载体人的信息。他分别切后，发现其中一个酶
有两个酶切位点，这个酶切出的片段大小和他用两个酶切出的是一样的。这说明这个酶
有一个位点在另外外一个酶位点里面，而且靠的很近。后来测序发现果然是这样。原理
做这个载体的人离开那个实验室，而后来的人根据他的NOTEBOOK做了个图，这个酶切位
点给漏掉了。也就是说他每次同时放两个酶同时切，其实最后两端是同一个酶切位点。
后来找了另外一个在最里面的酶做克隆，一次成功。
希望通过这个故事能解决你的问题。 |
|
c********u
发帖数: 250 | 35 transgenic mouse southern blot, 做了几个星期了还没出来,首要的问题如图，坑爹
的genomic DNA 用HindIII切了24个小时，60v 跑了6个小时，就给我跑成这副鬼样子，
大家提DNA， 溶DNA，切，跑胶有什么trick没？ 还有一个问题是，我的目标条带有
10kb，DIG probe, 我老板说10kb太大了，2-5kb最好，那我这种情况有可能成不？
真心求教，酌情发包子，谢谢。 |
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a******8
发帖数: 56 | 36 You can see your wells has strong signal. DNA digestion is not complete.
HindIII is NOT a good enzyme for southern. try other enzyme and then trouble
shoot other conditions. Good luck.
Your marker is good, I guess that you also labeled a small amount of marker,
which is good. |
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a**m
发帖数: 184 | 37 本科的时候做的。。。
HindIII怎么还用24小时？全都切得稀巴烂了吧。。。 |
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m**o
发帖数: 9137 | 38 一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来呀!把这个孽鬼绑上柱子!
生物博士：上柱子很关键，不然影响纯化回收的效率。我建议你们买进口的柱子。
法师：来呀!把这个恶鬼切了!
生物博士：用什么酶?EcoRI还是HindIII?
法师：我一定要给你点颜色看看!
生物博士：神马... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 39 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
vector
这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率？谢谢！ |
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j****n
发帖数: 3370 | 40 可能还好？不过感觉很看运气 尤其是蛋白质类产品
ps 我在用的一管restriction enzyme 2011年就过期了 貌似也没啥问题 hehe HindIII
-HF |
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